用户文章Food Chemistry | 基于芳香族氨基酸代谢研究臭豆腐卤中关键风味物质的形成机制

题目：The formation mechanisms of key flavor substances in stinky tofu brine based on metabolism of aromatic amino acids

发表期刊：Food Chemistry

影响因子：9.231

研究单位：韶关大学食品科学与技术学院        

技术手段：非靶代谢组学、宏基因组

简介

了解臭豆腐卤水中风味物质的形成机理，对控制长沙臭豆腐的风味品质具有重要意义。研究者重点研究了卤水中芳香族氨基酸代谢途径中相关细菌、酶和差异代谢物的动态变化。结果表明，苯酚(0.39~89.96 μg/mL)、对甲酚(0.19~389.62 μg/mL)、吲哚(1.14~242.97 μg/mL)、3-甲基吲哚(0.14~3.00 μg/mL)是卤水的主要风味物质,主要相关细菌梭状芽孢杆菌SYSU GA17129、动脉瘤杆菌/解硫胺素解硫胺素芽孢杆菌 、马氏厌氧菌与关键风味物质呈显著正相关(P <0.05),主要相关酶为转氨酶、脱羧酶和裂解酶。综上所述，苯酚和对甲酚分别由酪氨酸和苯丙氨酸代谢通过5个反应链形成，吲哚和3-甲基吲哚的形成分别由色氨酸代谢通过1个和3个反应链来进行。

01臭豆腐卤发酵过程中主要风味物质的变化

在卤水发酵过程中共鉴定出75种挥发性风味化合物，其中只有19种化合物在不同发酵阶段OAV >=1,见表1。其中苯酚、对甲酚、吲哚和3-甲基吲哚在不同发酵时间内的OAV高于其他化合物，被认为是主要的关键风味物质。此外在不同发酵阶段的卤水中还发现了其他一些风味物质，如醇、酸、醛、酯、胺等(OAV ≥1)，由所得结果可以看出，臭豆腐卤在整个发酵过程中都出现了对甲酚、吲哚和3-甲基吲哚，且OAV较高，这是臭豆腐卤在不同发酵阶段产生明显的酚类、泥状粪便气味的原因。臭豆腐卤的主要原料有豆腐、冬笋、盐渍晒干的大白菜、香菇等，其中含有大量的酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸(AAAs)物质，AAAs为酚类和吲哚类物质的形成提供物质基础。

表1 不同发酵期卤水中主要风味物质的含量、ROAVs及风味特征

02臭豆腐卤不同发酵阶段AAAs代谢途径相关的主要细菌和酶

为了弄清臭豆腐卤中主要风味物质(苯酚、对甲酚、吲哚和3-甲基吲哚)的形成机理，研究者采用宏基因组测序法对臭豆腐卤中微生物的类群和功能多样性进行了研究。

通过对菌群代谢通路进行分析，发现AAA代谢可能是卤水中酚类和吲哚类物质形成的主要通路。图2显示了细菌对卤水中四种AAAs代谢途径的贡献。根据所测细菌的数量和相对丰度，相对丰度为10%的细菌是主要的伴生细菌。在不同的AAA代谢途径中，大部分相关菌类型相同，但在不同发酵阶段相关菌类型差异显著。发酵前(0 d)，4种途径的主要相关菌包括未分类的Exiguobacterium, E. alkaliphilum, E. sp. AB2和Enterococcus。早期和中期阶段的发酵(15和30 d),相关的主要细菌为Massilibacterium senegalense，Sporanaerobacter acetigene、梭状芽孢杆菌SYSU GA17129。发酵中后期(分别为45和60 d)，主要相关菌为Paenalcaligenes homini。

之后研究者进一步研究了AAA代谢通路中的相关酶，探索了AAA代谢产生苯酚、对甲酚、吲哚和3-甲基吲哚的途径，如图3所示。从图中可以看出，同一途径在不同发酵阶段的相关酶与同一发酵阶段不同途径的相关酶在类型和丰度上存在较大差异。

结果表明，与AAA代谢相关的酶主要为转氨酶、醛酶、脱羧酶、单胺氧化酶和裂解酶。AAA在这些酶的作用下，通过转氨化、降解、脱羧、氧化、羟基化等一系列生化反应形成酚类和吲哚类物质。

图2 芳香族氨基的种类和功能对代谢的贡献

图3 芳香族氨基代谢的酶和功能

03不同发酵阶段AAA代谢途径中主要代谢产物的变化

研究者通过对卤水发酵过程中的总代谢产物进行测试和分析，验证基因功能的实现和表达，确定卤水中酚类和吲哚类物质形成的主要代谢途径。卤水发酵过程中AAA代谢途径的差异代谢产物包括21种代谢产物，分别为7种有机酸、3种吲哚和11种苯及其衍生物。21种不同代谢物相对含量的动态变化如图4所示。接近红色表示代谢物含量上调，接近蓝色表示代谢物含量下调。在0 d组，l -酪氨酸、l -苯丙氨酸、色氨酸、苯丙酮酸和对羟基苯丙酮酸的相对含量较高，但在发酵过程中下调。这五种物质是酚类物质和吲哚类物质在卤水中产生的主要前体和中间体。发酵15 d后，许多物质上调，产生大量中间体和少量酚类、吲哚类物质。其中，酪胺、苯乙胺和苯乙醛在发酵过程中最初显著上调，后期持续下调。发酵60 d时，酪胺和苯乙醛水平略有上调。发酵0~ 15 d时，去酸酶活性较强，l -酪氨酸、l -苯丙氨酸、苯丙酮酸和对羟基苯丙酮酸在脱羧酶的作用下分别产生酪胺、苯乙胺、苯乙醛和4-羟基苯乙醛，进一步生成对羟基苯乙酸和对甲酚。此外，由于色氨酸、羧基转移酶和裂解酶的高丰度，3个吲哚在这一阶段上调。发酵30和45 d后，由于酪胺、苯乙胺、苯乙醛等中间产物的一系列生化反应，3-甲基吲哚、对甲酚和酚类物质显著上调。发酵60 d后微生物演替，产生酚类和吲哚类风味物质的AAA代谢途径逐渐关闭，大部分代谢中间体、酚类和吲哚类风味物质下调。

图4 不同代谢物的热图

04臭豆腐卤水主要风味物质网络图的构建

基于相关菌、相关酶、相关酶等构建了主要风味物质(苯酚、对甲酚、吲哚、3-甲基吲哚)以及AAA代谢途径中的主要差异代谢物在卤水中形成途径的网络图如图5。

卤水中的吲哚可以通过色氨酸通过四个反应链产生吲哚-3-乙酸(图5;TR, TR, TR和TR)和3-吲哚乙酸在裂解酶作用下可以形成3-甲基吲哚(EC:4.1.1.115)。检测这些反应步骤所需的编码基因。除吲哚-3-乙酰胺外，还检测到了中间代谢物，并发现了相应的上调和下调关系。此外，色氨酸酶(EC:4.1.99.1)在主要吲哚产生阶段(15和30 d)具有较高的编码基因丰度，因此研究者推测TR是色氨酸代谢产生吲哚的主要途径。酪氨酸和苯丙氨酸也可以通过转氨化、脱羧、氧化和羟基化等一系列反应产生苯酚和对甲酚。酪氨酸可以通过两个反应链(图5 TY和TY)生成对羟基苯乙醛，对羟基苯乙醛通过醛脱氢酶转化为对羟基苯乙酸(EC:1.2.1.-)。然后，通过脱羧反应生成对甲酚和苯酚。苯丙氨酸也可以通过两个反应链形成苯乙醛(见图5 PH和PH)。苯乙醛通过苯乙醛脱氢酶(EC:1.2.1.39)生成苯乙酸，再通过羟化酶(EC:1.14.16.-)转化为苯氧苯乙酸，通过脱羧进一步形成对甲酚和苯酚。通过对相关酶和代谢物及其上调和下调关系的分析，发现卤水中转氨酶、单胺氧化酶、醛脱氢酶和脱羧酶的编码基因及其代谢物非常丰富。

研究者认为，酪氨酸和苯丙氨酸的转氨化、脱羧、氧化和羟基化等一系列生化反应是苯酚和对甲酚在卤水中形成的主要途径。

图5 卤水特有挥发性风味的代谢网络

结论本文研究了酚类和吲哚类化合物在卤水中的不同形成途径。结果表明，酚、对甲酚、吲哚、3-甲基吲哚是长沙风味臭豆腐卤的主要风味物质；主要细菌Clostridiaceae (C. bacterium SYSU GA17129)和Bacillaceae (a.a nameinilyticus)与卤水中酚、对甲酚、吲哚和3-甲基吲哚的含量有显著相关性。此外，酚类和吲哚类风味物质的主要代谢途径可归结为转氨酶、醛脱氢酶、脱羧酶、单胺氧化酶、裂解酶等作用下的转氨化、降解、脱羧、氧化、羟基化等一系列生化反应，形成了挥发性的AAA或前体物。但部分基因的具体表达和机制以及关键酶的作用机制仍有待确定，转录组学、蛋白质组学、基因敲除、基因沉默、AAA发酵模型等研究方法可进一步验证。

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