用户文章∣IF=8，代谢组学+微生物揭示挥发性DMNT保护植物抗小菜蛾侵害的作用机制-代谢组学专题

标题：Volatile DMNT directly protects plants against Plutella xylostella by disrupting the peritrophic matrix barrier in insect midgut

发表期刊：Food and Chemical Toxicology

影响因子：IF=8.14

发表时间：2021.2

技术手段：非靶向代谢组学、全转录组测序、16S rRNA基因测序

病虫害对作物质量和产量产生严重危害；因此，确定保护作物免受虫害的新方法具有重要的农业应用价值。作者对转基因拟南芥植物的分析表明，编码(3E)-4,8-二甲基1,3,7-nonatriene (DMNT)的五环三萜类合成酶1 (pentacyclic tricene synthase 1)的过表达导致了对小菜蛾(Plutella xylostella)的显著抗性。DMNT治疗严重破坏了营养周基质(PM)，这是一个从中肠壁细胞中隔离食物和病原体的物理屏障。DMNT抑制了PxMucin在中肠细胞中的表达，敲除PxMucin会导致PM破裂和小菜蛾死亡。16S rRNA基因测序结果显示，DMNT显著破坏了中肠微生物群，而中肠微生物对DMNT诱导的杀灭至关重要。因此，作者认为中肠菌群协助DMNT杀死小菜蛾。这些研究结果为小菜蛾的植物保护提供了一种新的方法。

01DMNT驱避并可以杀死小菜蛾幼虫

在研究拟南芥PEN1基因(at4g15340)的功能时，作者注意到过表达PEN1的转基因植株对小菜蛾的侵袭表现出较强的抗性(图1A, B)，而饲喂35Spro:PEN1转基因植株的小菜蛾幼虫存活率明显低于非转基因对照(图1C)。据报道，PEN1是挥发性DMNT生物合成的关键酶，作者对35Spro:PEN1转基因植物的代谢组(GC-MS)分析也证实了这一点。DMNT富集且能被小菜蛾侵染而高度诱导，表明DMNT可能在植物对这种咀嚼昆虫的抗性中发挥作用。为了验证这一假设，作者合成了DMNT，并在小菜蛾幼虫取食前喷洒在甘蓝型油菜叶片上;这一生物测定结果表明，与对照叶片相比，DMNT处理的叶片被吃掉的数量要少得多(图1D)。为了确定小菜蛾幼虫是否能感知DMNT并避免挥发性化学物质，作者进行了昆虫偏好试验。作者在玻璃试管的两端分别放置含有DMNT或石蜡油的饲料作为对照，并放置四龄小菜蛾。小菜蛾幼虫在管中心。如图1E所示，10-120 min后，小菜蛾幼虫离开DMNT侧的数量显著增加，表明小菜蛾幼虫感知并避开DMNT(图1E)。

图1 DMNT驱杀小菜蛾幼虫

同时，用含DMNT或石蜡油的饲料饲喂二龄幼虫，并对其成活率进行评分，研究该化合物是否能直接杀灭害虫。暴露于DMNT120h后，50%幼虫死亡，幼虫生长和化蛹率受到严重影响(图1F-I)。分别对小菜蛾幼虫饲喂含有0.7、7和70 μM DMNT的饲料，观察到剂量没有显著影响(图1)。随后作者选择了7 mM的DMNT用量进行进一步研究。

DMNT处理下，小菜蛾幼虫的采食量显著降低，排便减少，表明小菜蛾幼虫可能因饥饿而死亡。为了验证这一假设，作者比较了DMNT处理和饥饿(通过停止饲料喂养)对幼虫的死亡率的时间过程。如图2A所示，DMNT处理的小菜蛾幼虫比饥饿处理的至少早12小时死亡。此外，饥饿的幼虫在死亡时的身体比DMNT处理的幼虫小得多，表明小菜蛾幼虫很可能被DMNT迅速毒死，而不是被DMNT引起的饥饿杀死。鉴于DMNT对小菜蛾幼虫的生长有抑制作用，作者假设DMNT暴露48小时后，小菜蛾幼虫的肠道和中肠消化能力下降，以测定消化能力的指标——消化酶脂肪酶的活性。与对照组相比，DMNT处理的幼虫脂肪酶活性显著降低，这表明它们的肠道功能确实被破坏了(图2B)。

02DMNT处理可破坏小菜蛾幼虫的中肠屏障

为了确定DMNT导致害虫死亡的可能原因，作者进行了“Smurf 测试”，以检测昆虫中肠泄漏问题。这个测试使用蓝色染料，酸性蓝9钠盐;这种染料的分子量为792.85，由于太大而不能被动地通过肠道屏障，这使得它成为揭示肠道上皮内膜状态的有用工具。作者把染料加到草料中，让幼虫进食1小时，然后在不染色的情况下放回草料6小时(图2C)。饲喂期结束时，对照幼虫已将染料排出体外，未见染料在体内明显积聚。相比之下，DMNT处理的幼虫在中肠和周围组织中保留了大量的染料(图2D)，有效地使幼虫变成蓝色，就像蓝精灵卡通人物一样。对蓝色(蓝精灵)和正常(非蓝精灵)幼虫的定量评估表明，DMNT处理产生的蓝精灵幼虫数量是未处理的三倍(图2E)。这些结果表明，DMNT导致幼虫中肠损伤，并导致更高的通透性。

图二 DMNT对小菜蛾幼虫的中肠屏障进行破坏03PM被DMNT损坏

从对照和DMNT处理的幼虫中分离和解剖PM，在立体显微镜下进行结构对比分析。DMNT处理48小时后，PM变薄变松，而对照样品的PM保持完整和丰满(图3A, B)。为了进一步记录观察到的中肠损伤，作者对DMNT处理24-48小时的幼虫进行横切。苏木精-伊红(HE)染色显示对照幼虫的PM厚且完整(图3C, E)，而DMNT处理24小时的幼虫PM薄且在某些区域不连续(图3D)。这种效果在暴露于 DMNT 48 小时后变得更加明显，因为 PM 完全被破坏并且肠内容物接近肠壁，几个肠上皮细胞从上皮壁溢出（图 3F）。通过透射电子显微镜验证了这些结果（图 3G，H）。

图三 DMNT处理破坏了营养基质(PM)结构04DMNT抑制mucin-like基因PxMucin的表达

为了研究DMNT对小菜蛾幼虫的作用机制，作者进行了全转录组测序(RNA-seq)分析。与对照组相比，DMNT处理12小时后，有189个基因差异表达，有62个基因上调，127个基因下调。KEGG富集分析表明，这些差异表达基因属于20多种不同的代谢途径，包括酪氨酸、嘌呤和碳代谢、蛋白酶体、蜡质和长寿调节，与小菜蛾幼虫发育缺陷相吻合。一种编码黏蛋白样蛋白的蛋白质引起了作者的注意，因为据报道其蛋白质会在PM中积累(图4)。DMNT处理48小时后，与对照幼虫相比，PxMucin转录水平显著下调(图4B, C)。然后，作者利用体外转录技术合成了针对PxMucin的双链RNA (dsRNA)，并用覆盖有该dsRNA的拟南芥叶片喂养小菜蛾幼虫，结果导致生长、存活率和化蛹率显著降低，以及幼虫体变轻(图4F-I)。此外，dsrna喂养的幼虫的横切面显示PM结构变薄并在某些区域消失(图4J, K)，观察结果与DMNT处理的幼虫相似(图3)，表明DMNT可能通过抑制PxMucin表达部分破坏PM。

图4 DMNT通过抑制黏液蛋白样基因PxMucin破坏小菜蛾幼虫的营养基质(PM)结构05肠道微生物对DMNT功能至关重要

在小菜蛾PM和幼虫发育过程中，作者在饲料中添加抗生素混合物，有效地降低了中肠微生物区系。因此，作者用添加了抗生素的饲料喂养二龄幼虫。与蚊虫实验结果相比，抗生素处理对小菜蛾幼虫的存活率和化蛹率没有显著影响(图5A, B)。与此一致的是，横切面和HE染色显示，即使在抗生素混合物去除中肠微生物群后，PM仍然完整，这表明小菜蛾PM的形成和维持并不依赖于中肠微生物群。

为了测试中肠微生物是否会导致DMNT诱导的昆虫死亡，作者接下来将幼虫暴露在抗生素和DMNT的组合中。作者的结果表明，添加抗生素后，DMNT对小菜蛾的影响完全消除。这些结果也表明，抗生素处理后DMNT毒性的丧失扩大到保护PM结构免受DMNT诱导的损伤的可能性。

因此，作者对处理过的幼虫进行横切面和HE染色来验证这一假设。恰恰相反，中肠切片显示单独使用DMNT或联合使用DMNT和抗生素处理后的PM结构同样受损，表明活跃的肠道菌群有助于DMNT诱导的PM损伤，导致幼虫死亡，但肠道菌群并不直接影响PM(图5E-H)。此外，作者确定与对照组相比，DMNT损伤PM时，中肠菌群更容易通过PM屏障入侵中肠细胞(图5I, J)。

图5 中肠微生物对与DMNT介导的小菜蛾幼虫杀灭过程中是必需

06DMNT会导致肠道微生物数量失衡

作者进一步研究了DMNT处理后中肠系统内部微生物群的组成。基于16S rDNA测序的中肠微生物主成分分析显示，DMNT处理显著干扰了小菜蛾幼虫中肠微生物区系组成，其中变形菌门(proteobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)等18个门的丰度在DMNT处理后发生了强烈的变化(图6A)。例如，与对照相比，dmnt处理后的幼虫中厚壁菌门细菌Enterococcus富集了约85倍(图6B)。

作者发现，当幼虫生长到二龄阶段时，抗生素鸡尾酒几乎杀死了肠道中的微生物群。与抗生素处理对照相比，不饲喂DMNT时，肠道微生物显著降低了幼虫的存活率或化蛹率，而与DMNT同时饲喂肠道微生物则显著增强了DMNT处理的效果，120小时时所有幼虫均死亡，最终未化蛹(图6C, D)。此外，作者还检测了一种免疫因子溶菌酶的基因表达水平。RT-PCR结果显示，DMNT处理后48 ~ 72 h，幼虫肠道溶菌酶表达明显下调，说明DMNT处理后幼虫抵御病原菌侵袭的能力减弱。

图6 DMNT处理对小菜蛾幼虫的中肠菌群组成有影响

总结

作者描述了自然代谢物DMNT、中肠菌群和昆虫宿主死亡之间的相互作用。DMNT影响PM结构和杀死害虫的能力需要昆虫中肠菌群的帮助，这可能是其他生物中的普遍现象，并解释了如何防止肠道菌群感染其宿主。
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