用户文章∣微生物组+代谢组联合分析揭示了直肠癌中共生细菌和代谢物之间的相互作用—代谢组学专题

标题：Integrated microbiome and metabolome analysis reveals a novel interplay between commensal bacteria and metabolites in colorectal cancer

发表期刊：Theranostics

发表日期：2019年5月

影响因子：11.6

技术手段：非靶向代谢组、16S rRNA基因测序

结直肠癌（CRC）是一种恶性肿瘤，发病率在所有癌症中排名第三。研究表明肠道微生物及其代谢产物被认为是CRC发病的原因和调节因子。作者收集CRC患者（CRC组，n = 50）和健康志愿者（H组，n = 50）粪便标本，进行微生物组（16S rRNA基因测序）和代谢组分析，评估了结直肠癌患者的肠道菌群和代谢物。在粪便代谢组学分析鉴定出164种代谢物分布在40种代谢途径上。此外，H组和CRC组特异性代谢产物分别为42和17个。微生物多样性测序结果显示，两组间共有1084个OTUs， CRC组的物种多样性低于H组。在H志愿者和CRC患者的微生物群中鉴定出76个具有差异性的OTUs。综合分析将CRC相关微生物与多胺（尸胺和腐胺）等代谢物联系起来。证明肠道微生物组和代谢组（即多胺）之间存在一种新的相互作用。

01
 CRC相关的粪便菌群多样性下降

在微生物组结果中，经分类鉴定，共获得1084个OTUs。rank -丰度分布曲线显示，与H组相比，CRC组的丰富度降低，细菌相对失衡。对序列进行比对以估计alpha多样性和beta多样性。Shannon指数(3.73±1.39 vs . 4.35±0.90,p = 0.0093)、观察种数(204.56±98.32 vs . 257.46±64.61 p = 0.002)、Chao1指数(273.70±127.98 vs . 333.81±79.63,p = 0.0058)差异均有统计学意义，而Simpson指数(0.76±0.23 vs . 0.85±0.09,p = 0.0758)在CRC组与H组间无差异显著(图1A)。未加权和加权的PCoA图均显示两组在前三组PCoA的基础上分离(图1B)。这些结果表明，肠道菌群的多样性可能受到肿瘤负荷的强烈影响。

图1

02
 与结直肠癌相关的粪便菌群组成发生改变

对两组的优势类群在门水平上的相对比例进行评估。作者观察到各组样品的肠道菌群存在相当大的变异性(图1C)。每组共鉴定出12个门。Bacteroidetes是最主要的门，分别占CRC组和H组OTUs的46.8%和46.9%。此外，与H组相比，CRC组中Proteobacteria (23.9% vs . 7.2%)和Fusobacteria (6.6% vs . 0.1%)富集，而H组中Firmicutes (20.8% vs . 43.5%)富集。

图2

比较两组粪便菌群的差异。门水平上，H组厚壁菌门(p < 0.001)和放线菌门(p = 0.00812)显著多于CRC组；然而，与H组相比，CRC组的Fusobacteria (p = 0.00176)、Lentisphaerae (p = 0.0313)和Proteobacteria (p = 0.00163)也明显更多。在属水平上，两组间共有307个属存在显著差异。其中，志贺杆菌属(p < 0.001)、微单胞菌属(p = 0.0123)、梭杆菌属(p = 0.0196)、CFT112H7_norank (p = 0.0195)和卟啉单胞菌属(p = 0.0 3 2 9) ，在CRC组的细胞凋亡比H组的细胞凋亡多。

接着使用LEfSe来识别CRC相关的特定细菌(图2)。总共确定了76个具有差异性的OTUs。CRC组患者粪便中γ -变形菌门(Proteobacteria)、肠杆菌科(Enterobacteriales)、梭杆菌门(Fusobacteriales)等多种机会性致病菌均显著(LDA评分(log10) > 4)，而H组中以厚壁菌门(Firmicutes)、梭菌门(Clostridiales)、梭菌门(Clostridia)、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Selenomonadales、Negativicutes)和Faecalibacterium最为丰富(LDA评分(log10) > 3.6)。通过聚类分析，作者进一步分析了76个OTUs的相对丰度，并绘制了热图(图3)。H组富集58个OTUs, CRC组富集18个OTUs。这些数据表明，CRC组的微生物丰度远低于H组，这些差异丰富的微生物群足以区分H志愿者和CRC患者的微生物群。

图3

图4

03
  CRC和H组粪便代谢组中肠道代谢的概况

代谢组学共检测到H组和CRC组中226种代谢物，其中164种是共有的。这些代谢物被映射到约40种不同的KEGG代谢途径上，包括蛋白质生物合成（14种代谢物）、氨循环（5）和半乳糖代谢（6）。在H组中，代谢产物主要是糖（麦芽糖、果糖）、糖醇、胺（半乳糖胺）和大量的有机酸和脂肪酸（甘油、十八酸、己二酸、苯丙酸、亚油酸和油酸）。相比之下，CRC组的多胺（尸体胺、1,4-丁二胺）、氨基酸（Pro、Glu）和尿素的丰度较高，表明H组比CRC组更能维持碳水化合物代谢和肠道内更具还原性的环境（图4A）。

更重要的是，作者发现了几种在CRC或H组中特有的代谢物。例如，17种代谢物可能参与Asp代谢、氨循环、蛋白质生物合成和Trp代谢，支持肿瘤发生所需的环境（图4B）仅在CRC组中定量，即赖氨酸、庚二酸（赖氨酸的前体）、去甲缬氨酸和几种氨基酸和有机酸衍生物；作者还发现42种代谢物，在CRC组中根本检测不到。这些代谢产物主要参与Asp代谢、Ala代谢、蛋白质生物合成等（图4C），表明这些代谢途径在CRC患者中不太活跃。

图5

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 聚类、相关性和多变量分析揭示了H组和CRC组之间的差异代谢物

作者进一步对H组和CRC组的代谢物丰度进行了HCA分析。结果显示了以下三个大类:(i)糖和脂肪酸，H组的丰度高于CRC组，(ii)氨基酸和(iii)多胺、药物和其他代谢物，CRC组的丰度高于H组(图5A)。与这些结果一致的是，代谢物-代谢物Pearson相关分析也显示上述代谢物与CRC表型之间存在显著相关性。在H组观察到较高丰度的糖和糖醇，如果糖、二醇、sedoheptulose、麦芽糖、甘油、半乳糖胺和脂肪酸，如9,12 -十八酸、油酸、己二酸和戊二酸；氨基酸，如Phe、Pro、Ala、Lys、5-oxo-Pro、Val、Leu和Orn，也在CRC组中过多。PCA的结果也明确显示了H组和CRC组之间的差异，CRC组特异性代谢丰度和特征(图5B)。这些结果得到了OPLS-DA分析的进一步支持，其中几种特定代谢产物，如尸胺、Pro、Ala、1,4-丁二酸、尿素、Val、Lys、Leu、甘油、Ile、5-oxo-Pro、苯丙酸(即氢肉桂酸)、苯丙氨酸、sedoheptulose和Tyr，能够将CRC患者与H志愿者区分(图5C)。综上所述，作者的数据清晰而有力地表明CRC患者呈现特定的粪便代谢组。

图6

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CRC特异性代谢物的鉴定

基于上述粪便微生物组和代谢组数据，作者进行了基于Pearson相关性的聚类分析，以识别CRC中与微生物相关的代谢物(图6A)。作者观察到CRC患者与H志愿者之间的代谢物-微生物相关性更强，这表明CRC中异常富集的代谢物归因于肠道菌群失衡或与其相互作用。值得注意的是，这些数据只是表明了肠道微生物之间的潜在关联和代谢物，而不考虑两组之间的细菌丰度或受试者的饮食习惯的不同。作者进一步探究了76 OTUs相关的代谢物。结果显示CRC组中几个微生物-代谢物对存在正相关(图6B)。此外，一些目前可用的EI光谱库无法识别的未知代谢物也被发现与几个OTUs显著相关，这表明它们作为CRC患者生物标志物发现的未来目标的潜在作用，有待进一步注释。

图7

当作者计算粪便代谢物丰度的变异系数(CV)时，作者得到的CV范围为0-1，其中作者将0-0.25列为最小变量(噪声较小，可作为良好的生物标志物)，0.75-1 CV列为高度可变的代谢物(图6C)。作者观察到CRC样本中CV最低(变异性最小)的代谢物为胆兰-24-酸、缬氨酸、氨基丙酸、3-吡啶羧酸和Ala，而CV较高(变异性较高)的代谢物为未知物(其中5种)、甘油和磷酸。在作者观察到的H样品中，CV最低的代谢物为花生四烯酸、赖氨酸、十七烷酸、丁酸、戊癸酸、丙烯酸、己二酸、奥恩、丙酸、十八烷酸、苯甲酸、苯丙氨酸等。另一方面，较高的CV代谢物属于未知物(其中6个)，Asp、sedoheptulose、valeric acid和核糖。同样需要注意的是，Glu在CRC和H病例中都具有高度的可变性，而norLeu, 5-oxo-Pro, Trp，羟胺在粪便代谢组中的可变性最小，因此，可能不能作为定义健康和疾病状态的良好生物标志物。

根据这项分析，作者将多胺作为潜在的生物标志物，因为这些是在CRC组中发现的丰富代谢物。受试者工作特征(ROC)曲线分析显示，尸胺(曲线下面积(AUC)， 0.764;p = 5.4512E-5)和腐胺(AUC, 0.672;p = 0.015449)与CRC样本显著相关(图6D)。因此，多胺的诊断价值相当于或优于常规FOBT (AUC, 0.681;p = 0.002)。

总结

作者证明了基于GC -MS的非靶向代谢组学方法能够成功区分H和CRC志愿者，并将不同代谢物与健康状态或疾病表型关联起来。此外，粪便微生物组数据显示了代表H组和CRC患者组的典型微生物群，即H组CRC中Proteobacteria、Fusobacteria和Firmicutes富集，CRC中微生物多样性不均匀且较少。CRC中的多胺(尸胺、腐胺)是区分CRC与H状态的潜在生物标记物，有待于更大的、更长期的、跨地理景观的更大队列的进一步验证研究。这种基于已鉴定微生物和粪便代谢物的假定微生物代谢的综合分析，比单一数据集提供了更多的功能见解。

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