用户文章:孙良丹团队在NC发文揭示CaMK4在银屑病中的作用机制 | 转录调控专题
论文标题：Calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV promotes imiquimod-induced psoriatic inflammation via macrophages and keratinocytes in mice
刊登日期：2022年07月
发表杂志：Nature Communications
影响因子：17.694
研究机构：安徽医科大学第一附属医院皮肤科
技术手段：转录组测序、联川生物OmicStudio云平台
图1
首先，作者将非病变皮肤和健康皮肤作为对照，IHC分析表明，病变皮肤中CaMK4细胞明显增多（图1a）；qPCR分析表明，银屑病外周血CaMK4表达水平高于健康对照组（图1b）；流式分析表明，银屑病患者的外周T细胞亚群（CD4，CD8和双阴性（DN）细胞）和CD14单核细胞亚群中，CaMK4细胞占比和MFI都高于健康对照组。但每组CD14单核细胞亚群中的CaMK4表达水平均高于T细胞亚群（图1c）。相关性分析表明，CaMK4与促炎细胞因子的表达正相关（图1d）。
此外，作者通过IHC分析，发现与健康小鼠皮肤相比，IMQ（TLR7激动剂，可激活浆细胞样树突状细胞（pDC）产生干扰素（IFN））处理的小鼠皮肤中CaMK4表达上调（图1e）；WB和qPCR分析表明，CaMK4在银屑病小鼠皮肤中的巨噬细胞（F4/80）、树突状细胞（CD11c）和角质形成细胞（KCs）中高表达（图1f, g）。上述结果表明CaMK4可能在骨髓细胞和KCs中影响IMQ诱导的银屑病。
图2
接下来，作者使用Camk4-/-和Camk4+/+小鼠构建了IMQ诱导的银屑病小鼠模型。病变程度分析和IHC分析表明，与IMQ处理的Camk4+/+小鼠相比，IMQ处理的 Camk4-/-小鼠银屑病有所减轻（图 2a-d）。对病变皮肤进行转录组测序（联川生物提供），通过生信分析，发现多种致病因子高表达，并通过qPCR进行了验证（图2e, f）。
图3
由图1f，1g可知，IMQ处理使小鼠皮肤的F4/80+和CD11c+细胞中CaMK4表达上调。作者推测特定皮肤骨髓细胞亚群中也发生了相关变化。通过流式分析，发现CaMK4-/-小鼠皮肤中CD11b+ DCs占比降低，MHC Ⅱ+巨噬细胞占比升高，中性粒细胞和F4/80+CD11c+细胞没有差异（图3a,b）。由于先天免疫细胞（如DCs）被激活后可释放IL-23和IL-1β以激活αβ T细胞和γδ T细胞，后者产生IL17A导致KCs的异常增殖。作者研究发现IMQ处理可使γδ TCR+细胞占比下降（图3c），并使CaMK4-/-小鼠皮肤中IL17A+CD45+、IL-17A+CD4+和IL-17A+γδTCR+细胞的占比下降（图3d）。
此外，IMQ处理的CaMK4+/+小鼠皮肤中MHC II+巨噬细胞的比例增加（图3b），与IL-17A+ δγTCR+细胞负相关。因此CaMK4可能通过调控巨噬细胞促进银屑病。
图4 MHC Ⅱ+巨噬细胞是IMQ处理的Camk4-/-小鼠中IL-10的主要来源
巨噬细胞主要通过产生IL-10发挥调控功能。作者发现IMQ处理的Camk4-/-小鼠皮肤中的IL-10基因和蛋白水平明显高于IMQ处理的Camk4+/+小鼠（图4a, b）。IF免疫荧光和流式分析后，发现IMQ处理的Camk4-/-小鼠真皮中的F4/80+IL-10+巨噬细胞的数量有所增加（图4c），MHC II+巨噬细胞中的IL-10数量也大于IMQ处理过的Camk4+/+小鼠（图4d, e）。表明CaMK4可能调节MHC II+巨噬细胞中IL-10的产生。
图5 CaMK4通过ADCY1-cAMP-Erk1/ 2和p38途径抑制巨噬细胞产生IL-10
ADCY1-环磷酸腺苷（cAMP）信号是Erk1/2和p38的正向调节器，而Erk1/2和p38 MAPK途径参与调节骨髓细胞的IL-10基因。为了研究CaMK4如何调节巨噬细胞中IL-10的产生，作者在小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中进行了co-IP和WB实验，结果发现CaMK4与ADCY1发生相互作用（图5a）。并且与DMSO处理的BMDMs相比，IMQ处理的BMDMs中CaMK4的表达上调。在IMQ处理的BMDMs中，CaMK4抑制剂KN-93处理后明显增加了Erk1/2和p38的磷酸化；ADCY1抑制剂ST034307和KN-93的联合处理减少了Erk1/2和p38的磷酸化以及IL-10基因和蛋白水平。同时，加入cAMP后升高了Erk1/2和p38磷酸化，恢复了IL-10基因和蛋白水平（图5b-d）。这些数据表明，CaMK4下调了ADCY1-cAMP-Erk1/ 2和p38途径，从而抑制了巨噬细胞中IL-10的产生。
通过评估CaMK4在体外巨噬细胞极化中的调控，发现CaMK4缺失导致M2巨噬细胞基因表达上调（图5e）；在IMQ处理的Camk4-/- BMDMs中，吞噬作用相关基因表达上调（图5f）。这些数据表明，CaMK4限制了M2巨噬细胞的极化和巨噬细胞的吞噬作用。
与未经处理的外周单核细胞相比，用KN-93处理的外周单核细胞显示Erk1/2和p38磷酸化以及IL-10基因和蛋白水平增加（图5g-i）。KN-93处理的外周单核细胞中IL1B和IL12B的表达被下调（图5j）。
图6 Camk4-/- BMDM转移减轻了IMQ诱导的银屑病
引入Camk4−/−BMDM的IMQ处理的WT小鼠表现出较轻的银屑病和较低的皮肤致病因子（图6a-d），并且IL10的表达显著增加（图6e），表明CaMK4的缺失恢复了巨噬细胞中IL-10的产生，从而减轻了ImQ诱导的银屑病炎症。
图7 巨噬细胞中Camk4的敲除减轻了IMQ诱导的银屑病炎症
接下来，作者构建了CaMK4基因敲除小鼠模型。与对照相比，巨噬细胞中CaMK4的缺失减轻了IMQ诱导的银屑病炎症，从而使银屑病相关基因显著下调（图7a-d）。并由图7f, 7g可知，皮肤中增多的MHC Ⅱ+巨噬细胞有助于银屑病的缓解。
图8 CaMK4-AKT-NF-κB途径促进KC促炎表型
前面提到，IMQ处理可使小鼠皮肤中的CaMK4在免疫细胞和原代KCs中上调（图1f, g），表明CaMK4对KCs的调控机制。随后作者构建了小鼠KC细胞系HaCaT的CaMK4敲除瞬转株，并使用肿瘤坏死因子（TNF）和IL-17A模拟银屑病内部炎症环境来刺激该细胞。结果发现转染siCAMK4的HaCaT细胞在早期和晚期的凋亡率增加(图8a，b)，细胞增殖减少(图8C)，促炎基因表达下调（图8d）。
为了将细胞凋亡、细胞周期和促炎基因的表达情况联系起来，作者分析了NF-κB途径（调节抗凋亡因子抑制TNF诱导的细胞凋亡，调节CDK刺进细胞增殖，并诱导多种促炎基因转录）。由于报道称CaMK4调节AKT途径，co-IP结果发现CaMK4与AKT相互作用（图8e），并在敲除CaMK4后，AKT、IKKα/β和p65的磷酸化水平降低(图8f)。上述结果表明CaMK4通过AKT-NF-κB途径抑制KCs的凋亡，促进细胞增殖和促炎基因的表达。
图9
最后，作者评估了CaMK4抑制剂KN-93的体内治疗效果（图9a）。与PBS和IMQ处理的WT小鼠相比，用KN-93和IMQ处理的WT小鼠显示出较轻的银屑病炎症和较低的皮肤致病因子表达水平（图9b-f）。为了消除CaMK2的影响，qPCR分析发现IMQ处理的小鼠皮肤中CaMK2a和CaMK2b的表达降低，而两组小鼠之间CaMK2d和CaMK2g的表达没有差异（补充图9a）。此外，与IMQ处理的Camk4−/−小鼠相比，KN-93和IMQ处理的Camk4−/−小鼠的银屑病严重程度上没有差异。这些结果表明KN-93对IMQ诱导的银屑病的抑制作用主要是由CaMK4而不是CaMK2的抑制引起的。
该研究提供了CaMK4在银屑病发病机制中的潜在作用。在IMQ或AMP激活的巨噬细胞中，CaMK4通过ADCY1-cAMP-Erk1/2和p38途径上调，抑制IL-10的产生，并降低皮肤中IL-10的水平，从而促进银屑病炎症的发生。CaMK4还上调IL-1β和IL-12的表达，以刺激γδT细胞释放IL-17A。反过来，IL-17A导致KCs的过度增殖，产生AMP和趋化因子，通过CaMK4-AKT-NF-κB途径将免疫细胞富集到皮肤中。
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