CDD(IF=9.68)：lncRNA CYTOR是口腔鳞癌的潜在靶点| 转录调控专题
论文标题：lncRNA CYTOR promotes aberrant glycolysis and mitochondrial respiration via HNRNPC-mediated ZEB1 stabilization in oral squamous cell carcinoma
刊登日期：2022年07月
发表杂志：Cell Death & Disease
影响因子：9.685
研究机构：南京医科大学附属口腔医院口腔基础学科
技术手段：RNA-seq，RIP-seq
图1 CYTOR在OSCC发展中具有潜在的致癌和预后价值
为寻找与OSCC预后相关的lncRNA，作者从TCGA数据库中筛选出2934个lncRNA（图1A），另外使用GEO数据库筛选出在OSCC中有1533个基因上调（图1B）；通过联合分析，共有区域存在6个lncRNA（图1C）；使用Kaplan-Meier曲线对筛选的6个差异lncRNA进行评估，初步确定LINC00152（CYTOR）和HOTAIRM1可作为与OSCC预后相关（图1D）；对两个预后相关基因进行试验验证，结果发现LINC00152（CYTOR）在OSCC组中显著差异上调，CYTOR表达升高与OSCC患者的晚期临床阶段（图1G）和晚期病理分级（图1H）
相关，因此可确定CYTOR在OSCC发展中具有潜在的致癌和预后价值。
图2 CYTOR高表达促进了EMT介导的OSCC迁移和侵袭
FISH实验及Kaplan–Meier生存曲线分析结果表明CYTOR在OSCC患者的细胞受体上高表达，但其生存能力降低（图2A-B）；同时CYTOR表达升高导致OSCC患者的晚期临床阶段（图1G）和晚期病理分级加重（图2C-D）；通过qPCR比较肿瘤和临旁组织中细胞受体表达水平，结果表明其在OSCC组织中显著上调（图2E），相比于正常口腔上皮细胞系（HOK）其细胞受体表达显著增高（图2F）。CYTOR主要在OSCC细胞的细胞核中，较小程度定位在细胞质中。因此，CYTOR是与OSCC预后相关的强候选lncRNA.
图3
作者利用慢病毒感染HN6和Cal27细胞建立了敲低（KD）和过表达（OE）CYTOR的稳定细胞系（图3A-D）；通过5-乙炔基-20-脱氧尿苷（EdU）标记及CCK-8分析，结果表明CYTOR表达变化不影响口腔癌细胞的增殖（图3E-H）；Transwell分析表明，过表达CYTOR导致口腔癌细胞侵袭和迁移能力显著提升（图3G-I）。通过WB和免疫荧光染色发现，过表达CYTOR促进EMT的表达，敲除CYTOR抑制了OSCC中EMT的表达水平（图2J-K）。为确定CYTOR表达变化影响细胞迁移和侵袭的水平能直观表现，作者将用Dil标记的、稳定转染OYTOR表达载体的细胞系显微注射到血管绿色荧光转基因斑马鱼中，高表达CYTOR促进HN6、Cal27在斑马鱼中侵袭作用（图2M-N）；因此，CYTOR促进EMT介导的口腔癌细胞迁移和侵袭。
图4 CYTOR对口腔癌细胞糖酵解和线粒体呼吸功能的调节作用
作者对稳定表达CYTOR（KD）的Cal 27口腔癌细胞进行RNA-seq，结果表明，与对照组相比有772个基因上调，522个基因下调（图4A）；通过差异基因的富集分析，与CYTOR相关的基因主要富集在“氧化磷酸化”和“剪切体”中，表明CYTOR可能调节口腔癌细胞的线粒体功能和选择性剪接。
为验证CYTOR的表达与氧化磷酸化的关系，通过WB实验分析表明，敲低CYTOR组线粒体相关蛋白表达上调（图2C）；使用流式细胞术量化线粒体的超微结构发现敲低CYTOR显著转变癌细胞中线粒体形态的变化（圆形转变为长形，图2I）。
图5 CYTOR抑制HNRNPC的非降解泛素化
为解释CYTOR对癌细胞转移和线粒体代谢的调控作用，作者使用pull-down实验分析HN6和Cal细胞中CYTOR潜在的结合蛋白，利用银染色法和质谱分析鉴定确定了HNRNPC蛋白（图5A-B）；另外，运用RIP分析、琼脂糖凝胶电泳及qPCR表明HNRNPC与CYTOR存在特异性相互作用（图5C）。
为确定CYTOR与HNRNPC蛋白作用的特异性结合域，作者首先构建了CYTOR的生物素偶联探针（图5D），通过pull-down实验分析表明CYTOR的1-95nt和95-511nt区域可直接与HNRNPC相互作用（图5E）。lncRNA与RNA结合蛋白作用调节蛋白的泛素化，该研究中与CYTOR结合的HNRNPC蛋白具有赖氨酸残基的泛素化修饰（图5G-H），但通过WB分析表明CYTOR的表达变化不影响HNRNPC的蛋白丰度（图5I）；然而IP实验证实293T细胞中的敲低CYTOR显著增强了HNRNPC的泛素化水平（图5K-L），过表达CYTOR显著降低HNRNPC的泛素化水平。以上结果表明CYTOR显著抑制HNRNPC的泛素化水平，但不影响蛋白总体丰度。
图6 CYTOR介导HNRNPC增强ZEB 1的稳定性
为明确HNRNPC下游调控机制，对敲低HNRNP（KD）的口腔癌细胞进行RNA-seq，确定HNRNP-KD组有609个基因上调，571个基因下调（图6A）。另外，利用RIP-seq鉴定出2368个差异蛋白质编码基因。联合分析RNA-seq和RIP-seq的数据，发现共有153个差异基因（图6C）；同时，使用ENCODE eCLIP数据库结合RIP-seq分析出ZEB1和LIN28B是与HNRNPC作用可能性最高的基因。据报道HNRNPC与ZEB1在食管癌中具有显著的作用关系，故而假设HNRNP可能直接与ZEB1作用以延长其在口腔癌细胞中的稳定性。通过RIP和pull-down实验确定HNRNPC正调控ZEB1的表达（图6F-G）。此外，利用qPCR确定敲低和过表达CYTOR对ZEB1转录水平的影响，结果表明敲低CYTOR导致ZEB1表达降低，而过表达导致其转录水平升高（图6H）；另外WB实验证实CYTOR表达水平与ZEB1蛋白积累呈正相关（图6I）。另一方面，作者利用mRNA稳定抑制剂证实CYTOR或HNRNPC的缺失能够促进ZEB1的降解（图6K）。综上表明，CYTOR可以影响HNRNPC与ZEB1相互作用的能力，进一步增强口腔癌细胞中ZEB1的稳定性。
图7 ZEB 1对口腔鳞状细胞癌线粒体呼吸和有氧糖酵解介导的EMT的正调节作用
为研究ZEB1在口腔癌细胞中的作用，作者通过慢病毒包装敲低和过表达ZEB1的载体感染HN6和Cal27细胞系，Transwell和划痕实验表明ZEB1表达与口腔癌细胞迁移和侵袭水平呈正相关（图7A-C），在斑马鱼的转移实验也验证了这一观点。WB实验结果表明过表达ZEB1显著抑制线粒体代谢相关蛋白（Sirt3、CTP、SOD1和CS）的表达（图7F）；流式细胞术分析表明敲低ZEB1导致HN6和Cal27细胞系中活性氧（ROS）显著减少（图7G-H）；通过TEM进行的线粒体超微结构分析，敲低ZEB1导致癌细胞中线粒体形态伸长（图7M-O）。同时，作者将过表达ZEB1的载体转染到CYTOR-KD细胞系中，证明过表达ZEB1显著降低CYTOR-KD诱导的对癌细胞迁移和侵袭的抑制作用，同时逆转了CYTOR-KD诱导的EMT和线粒体功能的异常。在与有氧糖酵解和线粒体呼吸功能相关的发现表明，ZEB1过表达显著挽救了CYTOR-KD诱导的对细胞外酸化率（ECAR）和细胞耗氧率（OCR）的抑制。
图8 SIRT 3和COX 10是ZEB 1的转录靶点
为探索ZEB1调节线粒体代谢和糖酵解的机制，作者在基因转录调控数据库（GTRD）中筛选了由ZEB1进行转录调控的基因。该分析表明，SIRT3的启动子区是糖酵分解的负调节因子，COX10的启动子区域包含ZEB1结合位点。为检测敲低ZEB1癌细胞系中SIRT3和COX10基因的表达水平，通过WB和qPCR结果表明敲低ZEB1导致SIRT3表达显著高于对照组细胞，但COX10表达显著抑制（图8A-B）。另外，作者证明了ZEB1显著富集在SIRT3和COX10启动子区域（图8C-D），并通过荧光素酶报告系统证实敲低ZEB1可以促进SIRT3启动子驱动的荧光素活性，但抑制了COX10启动子荧光素的活性（图8E-F）。综上所述， ZEB1可以负调节SIRT3、激活COX10转录使其在OSCC中发挥调控功能。
图9 CYTOR-HNRNPC-ZEB 1轴是治疗口腔鳞状细胞癌的潜在治疗靶点
作者通过IHC检测了192例原发性OSCC样本中HNRNPC和ZEB1蛋白水平，结果显示HNRNPC表达水平与肿瘤浸润（P=0.019）和复发（P<0.001）之间存在显著相关性，而ZEB1表达与肿瘤复发显著相关（图9A）。在小鼠尾静脉转移模型中HNRNPC和ZEB1的表达水平升高也与总体生存率低相关（图9B-C），敲低CYTOR组抑制了OSCC向肺部转移（图9G）；与HE染色结果一致，口腔癌细胞在小鼠中显著减少（图9H-I）。因此，靶向CYTOR-HNRNPC-ZEB1轴可能是一种针对OSCC的稳健有效的治疗策略。
该研究筛选出与口腔鳞状细胞癌相关的lncRNA-CYTOR,并且证明了CYTOR增强了OSCC细胞的迁移和侵袭能力且证实CYTOR可以调控口腔癌细胞系的氧化应激和糖降解活性。通过RNA-seq、RIP-seq及ENCODE eCLIP数据库联合分析及实验证明lncRNA CYTOR-HNRNPC-ZEB1轴通过调节线粒体代谢和糖酵解促进口腔癌细胞的迁移和侵袭。另外，作者在裸鼠模型中证明了CYTOR的靶向抑制HNRNP的非降解泛素化保证ZEB1稳定调控，以降低口腔细胞癌的侵袭和转移能力。该研究揭示了lncRNA CYTOR-HNRNPC-ZEB1轴在调节口腔癌细胞线粒体代谢和糖酵解中的潜在作用，并说明了在抗转移癌治疗中lncRNA靶向的有效应用。
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