用户案例NC（IF=17）：单细胞测序揭示m6A介导巨噬细胞重编程影响肿瘤转移和生长 | m6A专题

标题：RNA中m6A甲基化修饰通过巨噬细胞重编程来协调肿瘤的生长和转移

发表期刊：Nature Communications

影响因子：17.694

发表时间：2021.03

技术手段：m6A测序、单细胞转录组

前言

肿瘤通过招募基质细胞来塑造肿瘤微环境以促进肿瘤生长，如肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)和调节性T细胞(treg)，这些都与患者预后不良相关。越来越多的研究表明，肿瘤微环境重新编程TAMs的基因表达，以重塑和维持免疫抑制功能。TAMs通常表现出一系列的激活状态。一般来说，它们偏离了“经典”激活的抗肿瘤表型(称为M1)，而转向了“交替”激活的原肿瘤表型(M2)。然而，与许多其他组织中的巨噬细胞一样，TAMs表现出显著的功能可塑性，并经常表达两种激活状态的标记物。目前负责建立和维护TAM功能的因素开始受到关注，而RNA m6A修饰调控相关的蛋白质就是候选之一。

m6A作为一种非常常见的mRNA修饰，而METTL3作为甲基转移酶复合物的催化亚基，相关研究表明该蛋白参与了精子发生、神经发生以及性别决定等生物过程。此外，异常的 m6A 修饰经常在癌症中发现，例如肺癌和结肠腺癌，并根据不同的靶基因发挥不同的作用。由于大多数研究主要集中在肿瘤内在的致癌途径上，m6A修饰在宿主抗肿瘤免疫反应中的潜在作用在很大程度上尚不清楚，作者基于此研究现状展开了以下研究。

主要结果：

1. 髓系细胞Mettl3的缺失促进肿瘤的生长和转移

为了探究髓系细胞中的Mettl3是否调节肿瘤的进展，首先，作者探究了髓系特异性的Mettl3缺失是否会影响肿瘤的生长。作者将B16或LLC细胞皮下注射到同基因的WT或KO小鼠中。KO小鼠的肿瘤生长速度明显快于WT小鼠，并且这些条件性Mettl3敲除小鼠的存活时间显著缩短(图1a-d)。此外，为了确定Mettl3是否能影响肿瘤转移，作者通过尾静脉将B16或LLC细胞注射到小鼠体内。与WT小鼠相比，KO小鼠的肺转移增强（图1e f）。值得注意的是，组织学检查显示，与WT小鼠相比，KO小鼠有更大更多的肺转移结节，Ki67染色增加（图1g-j），导致KO小鼠比WT小鼠总生存期缩短（图1k）。此外，作者观察到，与正常组织中的巨噬细胞相比，TAMs中Mettl3的表达减弱（图1I）。

图1 小鼠髓系特异性Mettl3缺失促进B16肿瘤生长和肺转移

作者接下来又进一步探索了髓系巨噬细胞中Mettl3的缺失是否会促进肿瘤的生长，作者用CFSE标记两种BMDMs，并与B16或LLC细胞共注射到小鼠皮下中。然后，提取肿瘤，并进行F4/80的免疫荧光染色，结果显示B16或LLC细胞与KO BMDMs共注射可显著加速肿瘤生长（图2a-f）。接下来，作者在实验前两天通过静脉注射氯膦酸钠脂质体来消耗小鼠体内的巨噬细胞。再将B16细胞静脉注射到小鼠体内。生物发光成像结果显示巨噬细胞的消耗消除了WT和KO小鼠肿瘤生长和转移的差异(图2g，h)，并且肺部肿瘤的组织学分析的结果也证实了这一点（图2i，j）。巨噬细胞被耗尽的小鼠的存活时间得到了延长，而用氯膦酸脂质体处理的WT和KO小鼠之间在存活时间上没有显著差异（图2k）。上述数据表明Mettl3在巨噬细胞中促进肿瘤进展中起着重要作用。

图2 Mettl3缺失的巨噬细胞可促进肿瘤生长和肺转移

2. Mettl3缺失的巨噬细胞通过增强M1和M2型TAMs和Treg对肿瘤的浸润来重塑肿瘤微环境

为了探究Mettl3对免疫微环境的影响，作者通过流式细胞术对脾和肺进行免疫表型分型，发现KO小鼠的M1巨噬细胞，M2巨噬细胞和调节性T细胞的总体百分比增加。为了进一步研究Mettl3对肿瘤微环境的影响，通过单细胞RNA测序分析，发现KO小鼠的肿瘤与WT小鼠的肿瘤在免疫细胞的组成上存在差异，其中TAMs、MDSCs和CD4+的数量增加，同时T细胞、粒细胞以及CD8+ T细胞数量呈下降的趋势。

此外，作者还通过流式细胞术对Mettl3缺陷巨噬细胞的肿瘤组织进行免疫表型分析，结果显示M1，M2型TAMs的总百分比增加（图3a），同时MDSCs和调节性T细胞的数量有增加的趋势（图3b-d）。有研究表明，Treg向各种肿瘤组织的迁移和浸润似乎依赖于肿瘤细胞或浸润性巨噬细胞产生的CCR4配体（CCL22）的表达。进一步的分析显示，通过qRT-PCR和ELISA检测，CCL22在mettl3缺陷的BMDMs和TAMs中CCL22的表达显著上调（图3e-f），针对这个发现，作者进一步探究了Treg细胞对肿瘤生长和转移的影响。作者首先通过注射抗CD25抗体消除WT和KO小鼠体内Treg细胞差异，结果表明Treg细胞差异的消除，使得WT和KO小鼠在肿瘤生长或转移方面差异变得不显著，同时也消除了这两种小鼠在生长方面的差异（图3g-l），以上结果说明了骨髓细胞中Mettl3的缺失通过TAMs浸润和Treg募集的方式促进了肿瘤的生长和转移。

图3 噬细胞中Mettl3的缺失通过增强肿瘤中的M1-和m2样TAM和Treg浸润来建立免疫抑制微环境

3. Mettl3缺失通过NF-kB/STAT3促进BMDMs的M1和M2极化

首先作者检测了M1和M2型巨噬细胞相关基因的表达，发现在Mettl3缺失的BMDMs中，Tnf-α、Il-6和Arg1的表达显著增加（图4a），ELISA结果也表明在mettl3缺失的BMDMs中，TNF-α和IL-6的表达发生了上调（图4b）；同时作者发现在mettl3缺失的BMDMs中，精氨酸酶的活性也出现了增强（图4c）。接下来作者探究了两个与免疫相关的经典通路：NF-κB和STAT3是否与BMDMs的极化有关，于是作者评估了BMDMs中p65和STAT3的磷酸化水平，并发现mettl3缺失的巨噬细胞中p65和STAT3磷酸化水平的增加（图4d）。通过NF-κB通路抑制剂的处理，Tnf-α、Il-6和Arg1的表达下降，而通过STAT3通路抑制剂的处理，WT BMDMs和KO BMDMs中Arg1的表达均发生了降低（图4e）。ChIP分析显示，p-STAT3可以特异性地与Arg1的启动子结合（图4f）。接下来，作者从患瘤小鼠中收集了TAMs，RT-qPCR结果显示，KO TAMs中M1和M2巨噬细胞相关基因的表达同时增加，这与p65和STAT3的磷酸化增强和ARG1的表达有关（图4g-i）。综上所述，这些数据表明，METTL3的缺失导致了NF-κB通路和STAT3信号通路的激活，从而导致M1和M2型巨噬细胞极化。

图4  Mettl3的缺失促进了BMDMs通过NF-kB/STAT3的M1和M2极化

4. 巨噬细胞通过调节细胞因子重塑肿瘤微环境

为了评估NF-κB/IL-6/STAT3信号轴在肿瘤微环境中的作用，作者将B16或LLC细胞与BMDM培养基或BMDMs一起孵育。结果显示，在p65磷酸化水平增加的B16和LLC细胞中，Il-6的表达上调，并通过使用Bay-11-7082阻断NF-κB通路而逆转（图5a），NF-κB抑制剂BAY-11-7082的处理逆转了肿瘤细胞Il-6的表达。此外，WT或KO BMDMs与Bay-11-7082或抗TNF-α中和抗体预孵育，然后与B16或LLC细胞共培养。qRT-PCR结果显示添加Bay-11-7082或抗TNF-α中和抗体可抑制Il-6的表达（图5c），同时p65和STAT3磷酸化水平降低（图5d）。此外，与WT BMDMs相比，在存在抗il-6中和抗体的B16或LLC细胞共培养的mettl3缺陷的BMDMs中，Arg1的表达显著降低（图5e，f）。这些数据表明，mettl3缺陷的巨噬细胞通过调节细胞因子反应重塑了肿瘤微环境。

图5 与肿瘤细胞共培养的mettl3缺失的巨噬细胞中，细胞因子的产生和NF-κB和STAT3的激活增强

5. METTL3的缺失会介导YTHDF1介导的SPRED2的翻译

为了研究m6A在巨噬细胞重编程中起到的作用，从WT和KO BMDMs中分离总RNA样本，通过m6A甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-Seq)进行m6A分析。m6A主要富集在终止密码子和3’UTR区（图6a），同时在不同样本内发现了一致的“GGAC”基序(图6b)。为了探究参与m6A调控的巨噬细胞极化的潜在靶点，作者将与MAPK通路相关基因与70个m6A下调的基因之间存在交集的基因作为候选基因。在这些基因中，结果表明Spred2的m6A水平显著降低(图6c，d)，有研究表明Spred2是控制ERK信号传导的负调控因子。此外， m6A-IP 和 qRT-PCR 也证实了 Spred2 是 m6A 调节的靶基因，接下来作者又发现KO BMDMs和TAMs中SPRED2蛋白的表达降低，而mRNA水平没有明显改变(图6f)，这说明m6A修饰对Spred2的衰减没有明显的影响。这里作者做出了一个假设：在mettl3缺失的BMDMs中，SPRED2蛋白表达的下调可能是由YTHDF1控制的蛋白翻译效率的差异所导致，YTHDF1是一种m6A相关阅读蛋白，能够促进基因翻译过程。为了验证这一假设，作者借助多聚体分析，qRT-PCR结果显示，KO BMDMs翻译活性多聚体(>80S)中的Spred2 mRNA水平显著低于WT BMDMs(图6i)。然后作者为了研究CDS中m6A甲基化是否能调控SPRED2的表达，突变了SPRED2 CDS上相关基序，并找到了m6A修饰调控的主要位点(图6j, k)。此外，RNA-IP结果显示，YTHDF1和Spred2在KO BMDMs中互作下降。

接下来为了证实YTHDF1在m6A调控SPRED2表达中的作用，作者敲除了YTHDF1在BMDMs中的表达。结果显示，YTHDF1的下调降低了BMDMs中SPRED2的表达，同时ERK、NF-κB和STAT3的磷酸化水平升高(图7a)。qRT-PCR分析显示，YTHDF1基因敲低后，Tnf-α、Il-6、Arg1和Ccl22的表达量增加(图7b-e)。此外，BMDMs中SPRED2的下调导致ERK、NF-κB和STAT3磷酸化水平的上调(图7f)，同时Tnf-α、Il-6、Arg1和Ccl22的表达增加(图7g-j)。总的来说，作者发现在BMDMs中Mettl3的缺失导致了YTHDF1介导的SPRED2翻译的减少，以及ERK、NF-κB和STAT3磷酸化水平的上调。

图6 METTL3的缺失介导YTHDF1介导的SPRED2的翻译

图7 敲除YTHDF1或SPRED2可通过NF-kB/STAT3通路增加Tnf-α、Il-6、Ccl22和Arg1的表达

6. 髓系细胞中Mettl3的缺失会损害PD-1阻断对B16黑色素瘤的治疗

为了评估靶向METTL3激活抗肿瘤反应的潜力，作者在B16肿瘤转移模型中测试了抗pd-1治疗。与预期的一样，作者发现在KO小鼠中，B16肿瘤对抗pd-1治疗的反应较差，表现出肿瘤生长和肺转移显著增加，而生存期缩短(图8a-f)。这意味着mettl3缺失的髓系细胞有助于B16肿瘤对抗pd-1治疗的耐药性。

图8 巨噬细胞中Mettl3的缺失会损害PD-1阻断B16肿瘤的治疗效果

总结：

在这项工作中，作者通过实验发现巨噬细胞中Mettl3的缺失，会通过TAMs浸润和Treg募集的方式促进肿瘤的生长和转移会促进肿瘤的进程，同时巨噬细胞Mettl3的缺失会激活NF-κB和STAT3通路，促进巨噬细胞的极化，并使巨噬细胞的功能发生紊乱；另一方面，作者通过实验发现巨噬细胞通过调节细胞因子重塑了肿瘤微环境。接下来作者又通过m6A测序，发现了METTL3的缺失介导了YTHDF1介导的SPRED2的翻译，找到了m6A修饰调控肿瘤进程的靶基因。最后作者还评估了靶向METTL3激活抗肿瘤反应的潜力，作者在B16肿瘤转移模型中测试了抗pd-1治疗，发现mettl3缺陷的髓系细胞有助于B16肿瘤对抗pd-1治疗的耐药性。

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