lncRNA LINREP通过m6A修饰招募PTBP1_HuR复合物促进胶质母细胞瘤的进展|m6A专题

期刊名称 Journal of Hematology & Oncology

影响因子：12

发表时间：2022

所用组学：lncRNA microarray，RNA-seq

1研究背景

选择性剪接（AS）是一种进化上保守的转录后细胞过程，它驱动着真核生物中转录组和蛋白质组的多样性，在GBM（胶质母细胞瘤）中，异常剪接异构体作为致癌驱动因素，并导致高度的肿瘤内异质性以及恶性表型转移。因此，揭示GBM中AS事件的潜在机制对于寻找新的靶向治疗策略至关重要。PTBP1是hnRNPs家族的一员，通过诱导外显子跳跃，被广泛认为是pre-mRNA剪接的关键调控因子。多项研究已经证实了PTBP1在GBM肿瘤发生和进展中的多种生物学功能，包括恶性转化、侵袭和粘附，然而，在GBM中，调节PTBP1表达或新的因素和精确机制尚不清楚。长链非编码RNA（lncRNAs），主要的表观遗传调控因子，在所有癌症类型中都异常表达，并参与了各种致癌过程，对于GBM中的异常AS，大多数lncRNA的功能作用和生物学意义目前尚不明确，因此，探索lncRNA如何与PTBP1相互作用调控AS，对于更好地理解人类GBM的致癌机制至关重要。

2结果

01


与ptbp1相互作用的lncRNA的筛选与鉴定

为了探讨ptbp1相互作用的lncRNA的作用，作者通过RIP-seq实验启动了这项研究，并筛选出了一些与ptbp1结合的lncRNA候选基因（图1A）。然后将ptbp1与前8个结合的lncRNAs（差异倍数>2，FDR < 0.01）与检测到的差异表达的lncRNAs（FDR < 0.01）进行整合。共鉴定出3个与ptbp1相互作用的lncRNA(图1B)。在这些lncRNA中，NONHSAT036725（重命名为LINREP）在GBM样本中增加了4倍以上（图1C）。RIP检测显示显著富集LINREP（图1D）。LINREP在人类中没有编码潜力。RNA-ISH检测证实，与低级别胶质瘤组织（n=54；LGG，WHO II-III）相比，LINREP在高级别胶质瘤组织（n=50；GBM，WHOIV级）中显著表达（图1E，F）。LINREP的上调预示着总生存期（OS）的显著缩短，并且是神经胶质瘤患者的一个独立的预后因素（图1G，H）。FISH和亚细胞分馏分析进一步证实，LINREP主要定位于GBM细胞核（图1I，J）。

有趣的是，根据RNA下拉分析中MS鉴定的独特肽段，作者发现两个RNA结合蛋白（rbp），HuR和PTBP1，是排名最高的靶蛋白（图1K)。在U87和U251细胞系中，通过RNA下拉和蛋白印迹检测，一致证实LINREP与HuR和PTBP1直接相互作用（图1L）。RIP检测结果显示，通过HuR抗体可显著富集LINREP（图1M）。此外，LINREP与HuR和PTBP1共定位，HuR共定位位于细胞核和细胞质中，PTBP1分别定位于U251细胞的细胞核中（图1N）。HuR和PTBP1在三个胶质瘤队列中均呈正相关。内源性和外源性Co-IP检测证实了PTBP1与HuR的相互作用（图1O）。

为了确定LINREP与HuR或PTBP1结合的区域，作者首先使用catRAPID在线算法来预测它们的相互作用倾向（图1P）。RNA下拉实验显示，LINREP与HuR和PTBP1的相互作用分别需要1-820nt和620-820nt区域（图1Q）。接下来，根据POSTAR2 提供的HuR和PTBP1的RBP结合位点的序列基序和结构偏好（图1R），作者构建了另一系列的LINREP截断质粒。序列缺失分析表明，LINREP的420-530nt区域是与HuR相互作用时不可或缺的区域，而PTBP1则是结合到LINREP的620-690nt区域。

图 1

02


 LINREP促进了GBM细胞的生长和运动

为了阐明LINREP在GBM中的生物学功能，作者首先验证了LINREP在GBM细胞系中的表达水平，并选择了U87和U251细胞系进行进一步研究(图。S2A–C).作为指示 通过EdU和CCK-8增殖试验，LINREP敲低抑制了细胞生长（图2A-C）,此外，transwell和划痕伤口愈合试验显示，LINREP的敲低显著降低了GBM细胞的迁移和侵袭能力（图2D-H），体内实验结果证实，LINREP的上调显著促进了小鼠的原位瘤形成，缩短了小鼠的生存时间（图2I-K）。

图 2

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LINREP保护PTBP1免受泛素-蛋白酶体降解

作者研究了LINREP是否会影响HuR和PTBP1的表达。然而，LINREP的缺失或上调明显地改变了PTBP1蛋白的水平，而对 PTBP1的mRNA和HuR蛋白水平没有影响（图3A）。S2M和S2N，LINREP的上调也增加了患瘤小鼠GBM组织中PTBP1蛋白的表达。重要的是，在人脑胶质瘤组织中，LINREP的表达水平与PTBP1的表达呈正相关(图。S3D).RIP分析表明，LINREP结合了全长的PTBP1(图3B)。MG132给药试验显示，MG132逆转了LINREP对GBM细胞系中PTBP1稳定性的影响(图3C、D)，作者进一步使用环己胺（CHX）阻断了从头蛋白的合成。相比之下，当LINREP修饰的U87和U251细胞用CHX处理时，免疫印迹分析显示，LINREP的敲除显著加快了PTBP1的降解速率(图3E )。相反，LINREP的上调延长了PTBP1的半衰期(图3f)。Co-IP检测证实，在过表达LINREP的细胞中，PTBP1的泛素化作用减弱，而沉默LINREP则产生相反的作用（图3G）。综上所述，这些结果证明了LINREP可以保护PTBP1免受泛素-蛋白酶体降解。

图 3

04


LINREP通过与PTBP1的关联来调控转录本的AS

考虑到PTBP1作为一个经典的剪接因子，作者使用RNA-seq研究了LINREP与PTBP1相互作用过程中AS的变化。选择基于FDR < 0.05和|IncLevelDifference|>0.2的剪接变化。作者发现，LINREP或PTBP1基因敲低可以影响所有五种类型的AS事件。其中，SE事件是受影响最大的（图4A、B）。重要的是，随后的分析表明，LINREP和PTBP1调控了来自SE型的175个常见的剪接基因（图4c）。GO分析显示，这些基因主要涉及到癌细胞的运动和生长（图4D）。接下来，作者选择了最大的差异剪接基因，通过敲除LINREP或PTBP1，在GBM细胞中发现了5个具有相似外显子使用模式的代表性基因（RTN4、MAP4K4、PICALM、TPM1和RAPGEF1）(图4e)。特别是RTN4是5个基因中最显著的剪接变化，之前它已经被认为是ptbp1介导的剪接靶点。

如图4G所示，RTN4第3外显子的剪接调控产生了两个不同的RTN4基因产物——RTN4A（保留形式）和RTN4B（跳过形式）。然后，作者通过TSVdb分析了GBM和正常脑组织中RTN4第3外显子的AS。与正常组相比，GBM中RTN4A的标准化表达水平较低，而RTN4B在GBM中的表达水平较高（图4H）。来自TCGA数据库的RNA-seq数据显示，RTN4作为一个致癌基因，增强了不良预后。此外，RTN4A的上调确实显著减少了GBM细胞的增殖、迁移和侵袭。

TSVdb结果表明，高水平的PTBP1表达与RTN4第3外显子以及GBM中其他4个基因的跳变增加有关(图4i)。LINREP表达与RTN4外显子3跳跃之间的相关性也被亚型特异性蛋白印迹分析证实(图4j)。此外，在U87和U251细胞中，PTBP1的重新引入在一定程度上挽救了LINREP沉默诱导的RTN43外显子跳跃减少(图4k、L)。同样，RTN4第3外显子的跳跃与GBM组织中LINREP的表达相关（图4M，N）。RIP检测表明，在U87和U251细胞中，LINREP的缺失损害了PTBP1与RTN4转录本的结合(图4o)，提示LINREP可能以另一种方式调控RTN4第3外显子的跳跃。

有研究报道，PTBP1靶基因上的结合位点通常位于剪接外显子上游序列（准确地说是在之前的内含子上），RIP检测显示PTBP1确实与pre-RTN4结合，随后，作者构建了几种生物信息学工具预测的pre-RTN4内含子2上的结合位点的突变体，并进行了RNA下拉分析表明PTBP1确实与pre-RTN4的内含子2相互作用。

图 4

05


LINREP促进UPF1从PTBP1中解离，增强RTN4第3外显子跳跃

有研究表明蛋白质-蛋白质相互作用影响了剪接因子的rna结合能力。因此，作者推测LINREP可能通过改变PTBP1与其蛋白伙伴之间的相互作用来调控PTBP1与RTN4转录本的相互作用。基于MS的筛选标准：confidence ≥ 95%，unique peptides ≥ 1，作者分别从ASO-NC和ASO-LINREP组中发现了148和123个假定蛋白（图5A）。选择ASO-NC和ASO-LINREP组间表达量差异最显著的的8个蛋白（UPF1、LRPPRC、FAM120A、TRAJ56、HNRNPU、FXR1、NCL和MOV10）。其中，UPF1是 在LINREP敲除的组中显著增加。研究表明，PTBP1直接与UPF1结合，可以保护mrna免受无意义介导的衰变，有趣的是，作者发现UPF1和PTBP1主要位于HPA的U251细胞细胞核中。通过免疫染色，UPF1和PTBP1共定位于U87细胞的细胞核（图5B）。Co-IP检测也证实了在GBM和HEK293细胞中，UPF1与PTBP1直接相互作用（图5C，D）。

序列缺失分析显示，UPF1主要与全长PTBP1相互作用（图5E），UPF1包含两个保守的结构域：CH结构域（残基123-213）和解旋酶核心结构域(残基295-914）。如图5F所示，如图5f所示，只有在UPF1的解旋酶核心结构域存在时，Flag-PTBP1才存在于co-IPs中，表明解旋酶核心结构域对PTBP1与UPF1的整合至关重要。

RNA-seq的前10个生物富集分析表明，UPF1参与了细胞运动和细胞生长(图5G)。沉默UPF1导致RTN4第3外显子的跳过，而UPF1的上调则没有改变PTBP1 mRNA和蛋白表达的影响(Fig. 5H)。与这些结果一致，IGV表明UPF1的缺失促进了U251细胞系的外显子跳跃(图5i)。RIP分析进一步证明了PTBP1与 UPF1敲低后，U87和U251细胞中RTN4转录本增加（图5K）。如图5l，在UPF1敲低后的GBM细胞中，对LINREP缺失反应的RTN4外显子3的跳跃得到了一定程度的挽救。作者发现UPF1并没有与 RTN4转录本结合。LINREP和PTBP1的敲除均没有促进UPF1与RTN4转录本的结合(图。S7L，M)，表明UPF1并没有与PTBP1竞争与RTN4的相互作用，但是通过抑制PTBP1的RNA结合能力来介导的选择性剪接。

作者发现无论在GBM细胞中LINREP的表达水平如何，UPF1 mRNA和蛋白水平的变化均不明显。然而，在HEK293细胞中，LINREP的上调导致与Flag-PTBP1沉淀时His-UPF1蛋白减少(图5m)，在U87和U251细胞中，LINREP的表达升高，而LINREP的缺失的作用则相反(图5N)。有趣的是，在GBM细胞中，外源表达的LINREP增强了UPF1从细胞核到细胞质的运输，表明LINREP促进了UPF1从PTBP1和ultim的分离 最终导致了UPF1的核质运输。

图 5

06


LINREP诱导的PTBP1上调促进了GBM细胞的生长和侵袭

为了阐明LINREP诱导的肿瘤发生是否需要PTBP1，作者在LINREP耗尽后将PTBP1重新导入GBM细胞，结果显示，降低LINREP的表达显著降低了GBM细胞的增殖和侵袭，而异位PTBP1则消除了体外细胞的作用（图6a-g）。此外，体内实验显示，U87- LINREP组表现出更大体积的肿瘤和更短的生存时间，这可以通过PTBP1敲低来消除（图6h-j）。IHC显示PTBP1蛋白表达水平随着LINREP的上调而升高。此外，下调PTBP1基因挽救了LINREP上调诱导的RTN4A的衰减（图6k）。

为了支持上述观点，作者首先通过突变ptbp1结合区（LINREP ΔPTBP1）构建了LINREP截断的质粒，接下来的RNA下拉分析显示，该区域确实是LINREP与PTBP1相互作用所不可或缺的。当LINREPΔPTBP1在内源性耗尽的GBM细胞中被诱导时 与野生型相比，超LINREP、PTBP1水平减弱和RTN4第3外显子跳跃减少不能被挽救（图6l-m），当在内源性LINREP耗尽的GBM细胞中诱导LINREPΔPTBP1时，与野生-相比，PTBP1水平的减弱和RTN4第3外显子跳跃性的减少并不能被挽救。此外，这些细胞的增殖、迁移和侵袭能力几乎被取消。体内实验也显示，LINREPΔPTBP1显著抑制了患瘤小鼠的异种移植瘤生长。综上所述，LINREP对PTBP1的影响确实与它们的相互作用有关。

图 6

07


HuR通过m6A依赖的方式增强了LINREP的稳定性

HuR在神经胶质瘤中高表达与预后不良相关（图7A）。已被证明可以优先结合和稳定m6A修饰的RNA。有趣的是，敲除HuR显著抑制了LINREP的表达，并减少了LINREP的半衰期（图7B）。作者构建了在HuR（LINREP ΔHuR）结合区突变的LINREP截断质粒。RNA下拉实验显示，LINREP ΔHuR失去了与HuR的相互作用，而与PT的结合 BP1没有受到影响。当LINREP ΔHuR被引入LINREP敲低的GBM细胞时，PTBP1蛋白水平下降，RTN4外显子3的跳跃性减少以及LINREP沉默诱导的细胞增殖和运动性的减少都得到了一定程度的挽救。然而，与过表达LINREP WT的LINREP敲除GBM细胞相比，这些作用仍然受损。与预期的一样，LINREPΔHuR的半场时间显著减少。因此，作者推测LINREP在PTBP1中的调控作用可能因HUR结合区域的缺失而受到损害。

此外，作者通过MeRIP检测在U87和U251细胞系中验证了m6A对LINREP上的修饰（图7C），m6A的甲基化的过程是可逆的，并由甲基转移酶（writer）、去甲基化酶（eraser）和效应蛋白（reader）动态调节。内源性METTL3的沉默降低了LINREP的表达，而ALKBH5的下调则增加了GBM细胞中LINREP的表达(图7d、E)，此外，METTL3的缺失导致了LINREP上m6A水平的降低以及LINREP的衰减，表明METTL3是GBM中LINREP主要的m6A甲基化酶（图7F，G）。然而，当作者在GBM细胞系中敲除METTL3时，，并没有使PTN4转录本中PTBP1蛋白水平和第3外显子的跳跃显著减弱,即使METTL3的缺失降低了LINREP的表达。作者推测GBM细胞中METTL3有多种下游靶点转录本。这可能会抵消LINREP对PTBP1的调控作用，最终导致PTBP1的水平和活性不变。

为了明确HuR是否以m6A依赖的方式稳定了LINREP，作者进一步检测了m6A和HuR在U87细胞中的分布。共聚焦成像显示m6A与HuR共定位（图7H），在huR沉默的U251细胞中，METTL3稳定LINREP转录本的能力减弱（图7I）。此外，在mettl3敲低的U251细胞中，RIP检测显示HuR与LINREP的结合能力显著降低（图7J）。

通过SRAMP网站m6A位点预测，LINREP上共有3个m6A基序（GGAC）(图7k)，图7L说明了LINREPΔm6A/741突变和LINREPΔm6A/1185突变可显著降低LINREP的半衰期。此外，Me-RIP检测显示，在LINREPΔm6A/ 741突变或Δm6A/1185突变中，LINREPΔm6A/741 + 1185双突变中的m6A修饰受损更加严重（图7M）。因此，在LINREP的741 nt和1185 nt处的m6A修饰在介导LINREP的稳定性中发挥了共同的作用，作者进一步上调了GBM细胞中的LINREP WT或LINREPΔm6A/ 741 + 1185的表达，结果显示，与LINREP WT相比，过表达LINREP Δm6A/ 741 + 1185的GBM细胞中RTN4第3外显子的跳跃性、细胞增殖和运动能力均降低，说明LINREP本身的m6A修饰对其在GBM中的生物学功能是必要的。

图 7

3 总结

这篇文章发现了在ptbp1诱导的AS中，lncRNAs和m6 A修饰之间的功能联系（图8）。这些发现可能为新的癌症生物标志物和治疗药物提供一个有吸引力的靶点。

图 8

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