NC—RNA m6A甲基化通过巨噬细胞重编程协调癌症生长和转移 | 单细胞专题

巨噬细胞的分类：除了经典的M1、M2之外，还有肿瘤相关巨噬细胞、CD169+巨噬细胞、TCR+巨噬细胞。巨噬细胞是天然免疫系统特化的，存活时间长，具有吞噬作用的细胞。巨噬细胞参与细胞碎片和病原体的识别、吞噬和降解。巨噬细胞还在向T细胞呈递抗原以及诱导其他抗原呈递细胞表达共刺激分子等方面发挥作用，从而启动适应性免疫反应。

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)：从严格意义上说TAM并不被认为是巨噬细胞中的一个亚群，因为这些细胞不是在稳态条件下存在，而是在许多肿瘤中被观察到。TAM是与特定病理情况相关的巨噬细胞，其活化状态类似M2巨噬细胞。然而，也有实验证据表明TAM不仅是一个独特的M2髓样细胞群体，而且还有同时具备M1和M2信号。

N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是一种可逆的mRNA修饰，在各种生物过程中发挥着重要作用。然而，m⁶A修饰在巨噬细胞中的作用仍然未知。2021年3月发表在《Nature Communications》的一篇经典文章，对RNA m⁶A甲基化在巨噬细胞中的功能和作用机制进行了深入研究。该研究发现骨髓细胞中Mettl3的敲除可促进体内肿瘤的生长和转移，并阐明了该过程的分子机理。该结果为寻找肿瘤免疫治疗靶点提供了一个新的方向。

 

论文标题：RNA m⁶A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming

刊登日期：2021年03月

发表杂志：Nature Communications

影响因子：17.694

研究机构：第四军医大学免疫学系

技术手段：MeRIP-seq、m⁶A-IP-qPCR、scRNA-seq

一、骨髓特异性缺失METTL3促进肿瘤生长和转移

为了研究m⁶A修饰在巨噬细胞中的作用，作者将WT BMDMs(骨髓源性巨噬细胞)与B16细胞共孵育，结果表明Mettl3的表达显著降低，而Mettl14的水平没有明显的差异。蛋白质印迹分析证实METTL3蛋白表达降低。为了进一步表征Mettl3基因的表达，作者从同一宿主小鼠的肿瘤组织和BMDMs中分离了TAM，并发现在肿瘤进展过程中TAM的Mettl3转录物水平降低。该结果也通过qRT-PCR和蛋白质印迹实验得到证实。

接下来的问题是Mettl3的髓样特异性缺失是否影响肿瘤的生长？作者将B16或LLC细胞皮下注射到同系WT或KO小鼠中。与WT小鼠相比，KO小鼠表现出明显更快的肿瘤生长，并且条件性Mettl3基因敲除小鼠的存活期缩短了（图1a-d）。此外，为了确定METTL3是否可以影响肿瘤转移，作者通过尾静脉将B16或LLC细胞注入小鼠体内。生物发光成像表明，与野生型小鼠相比，KO小鼠的肺转移增强了（图1e，f）。组织学检查显示，与WT小鼠相比，KO小鼠有更大、更多的肺转移结节且Ki67染色增加(图1g-j)，导致KO小鼠比WT小鼠总生存时间缩短(图1k)。此外，与正常组织中的巨噬细胞相比，TAMs中Mettl3的表达减弱（图1l)。上述结果说明Mettl3在骨髓细胞中的缺失会导致肿瘤的生长和增殖。

图1

上述 METTL3 缺失对肿瘤进展的影响结果非常显著，但尚不能确定BMDMs中Mettl3的缺失是否会促进肿瘤生长。为了进一步探讨，作者建立了巨噬细胞和肿瘤细胞的混合模型。结果表明：CFSE标记的细胞对F4 / 80染色呈阳性。B16或LLC细胞与KO BMDM共同注射可显著加速肿瘤的生长。生物发光成像显示，巨噬细胞耗竭消除了WT和KO小鼠之间肿瘤生长和转移的差异（图2a-k）。上述结果表明，METTL3在巨噬细胞中在促进肿瘤进展中起着至关重要的作用。

图2

二、巨噬细胞中的Mettl3缺失通过增强M1和M2样TAM和Treg浸润到肿瘤中来重塑肿瘤微环境

下一步作者评估了METTL3对免疫微环境的影响。作者通过流式细胞术对脾脏和肺进行免疫分型，并确定M1巨噬细胞、M2巨噬细胞和调节性T细胞的总百分比增加。为了进一步研究METTL3对肿瘤微环境的影响，作者通过scRNA-seq分析了WT或KO小鼠肿瘤中的CD45+细胞，揭示了23种不同的肿瘤内免疫细胞群。KO小鼠的肿瘤与WT小鼠的肿瘤相比，免疫浸润液的成分有所不同，包括TAM，MDSC和CD4+ T细胞数量增加以及粒细胞和CD8+ T细胞数量减少的趋势。

通过流式细胞术用METTL3缺失型巨噬细胞对肿瘤组织进行免疫表型分析显示，M1和M2样TAM的总百分比增加（图3a）。此外，骨髓来源的抑制性细胞（MDSC）和调节性T细胞的数量也有增加的趋势（图3b-d），而CD3+ CD4+和CD3+ CD8+ T细胞的总百分比没有受到影响。先前的研究表明，Treg迁移和浸润到各种肿瘤组织中似乎取决于肿瘤细胞或浸润巨噬细胞产生的CCR4配体（CCL22）的表达，因此作者在进一步研究中（通过qRT-PCR和ELISA测量）发现在缺乏Mett13的BMDM和TAM中CCL22表达显著上调（图3e, f）。这些发现促使作者检查Treg缺失对肿瘤生长和转移的影响。作者研究了注射抗CD25抗体对Tregs水平的影响。结果表明巨噬细胞中的Mettl3缺失以依赖于M1 / M2样TAM浸润和Treg募集的方式促进了肿瘤的生长和转移（图3g-l）。

图3

三、Mettl3敲除通过NF-kB / STAT3轴促进BMDMs中M1和M2极化

为了表征METTL3可能参与巨噬细胞极化， qRT-PCR结果表明，在缺乏Mettl3的BMDM中，Tnf-α，Il-6和Arg1的表达明显上调。接下来，作者测试了M1和M2巨噬细胞相关基因的表达，发现在Mettl3缺失的BMDM中Tnf-α，Il-6和Arg1的表达显著增加。TNF-α和IL-6的表达上调，而IL-10的表达则相对不变。精氨酸酶活性的提高（图4a-c）。

由于NF-κB是宿主先天性和适应性免疫反应的主要参与者，调节促炎性细胞因子的表达，而STAT3是MDSC扩展的主要驱动力之一，并参与髓样细胞介导的免疫抑制。因此作者评估了BMDM中p65和STAT3的磷酸化，结果表明Mettl3缺失的巨噬细胞中p65和STAT3的磷酸化水平增加。抑制NF-κB降低了WT BMDM和KO BMDMs中Tnf-α，Il-6和Arg1的表达，抑制STAT3途径降低了Arg1的表达。ChIP分析表明，p-STAT3与Arg1的启动子特异性结合（图4d-f）。

接下来，作者通过流式细胞仪检测的TAM纯度。结果表明，KO TAM中M1和M2巨噬细胞相关基因的表达同时增加，这与p65和STAT3的磷酸化增强以及ARG1的表达增强（图4g–i）。总体而言，METTL3的缺失导致NF-κB通路和STAT3信号的激活，从而导致M1和M2样巨噬细胞极化。

图4

四、肿瘤细胞促进细胞因子的产生以及Mettl3缺失巨噬细胞中NF-κB和STAT3的激活

由于NF-κB和STAT3可受细胞外源性因子TNF-α或IL-6刺激BMDMs调节。免疫印迹结果显示，KO BMDMs诱导p-p65和p-STAT3的能力比WT更明显。qRT-PCR分析显示TNF-α处理后TNF-α和IL-6的表达增加，通过bay11-7082阻断NF-κB通路后逆转，而IL-6作用后，Arg1的表达增加，通过STAT3抑制剂S3I-201处理后逆转。这些结果提示，NF-κB/IL-6/STAT3信号轴在KO BMDMs中比WT BMDMs更活跃。

为了评估NF-κB/IL-6/STAT3信号轴在肿瘤微环境中的作用，将B16或LLC细胞与BMDMs孵育，发现IL-6在B16和LLC细胞中表达上调，p65磷酸化水平增加，并通过bay11 -7082阻断NF-κB通路后逆转(图5a)。进一步发现TNF-α治疗不仅增加了p65的磷酸化也增加IL-6的表达，用NF -κB抑制剂处理可逆转肿瘤细胞中IL-6的表达(图5b)。此外，WT或KO BMDMs用bay11 -7082或抗TNF-α抗体前处理然后与B16或LLC细胞共培养。qRT-PCR分析显示，bbay11 -7082或抗TNF-α抗体的加入抑制了IL-6的表达(图5c)，伴随p65和STAT3磷酸化降低(图5 d)。此外，在mettl3缺失的BMDMs与B16或LLC细胞共培养时，与WT BMDMs相比，Arg1的表达明显降低(图5e, f)。总之，这些数据表明，mettl3缺失的巨噬细胞通过调节细胞因子反应重塑了肿瘤微环境。

图5

五、METTL3的丢失会损害YTHDF1介导的SPRED2的翻译

为了研究m⁶A在巨噬细胞重编程中的作用，使用m⁶A甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-Seq）从WT和KO BMDM中分离了总RNA样品以进行m⁶A分析。为了表征参与m⁶A调节的巨噬细胞极化的潜在靶标，作者鉴定了具有关键功能的MAPK途径相关基因和70个m⁶A下调的基因之间重叠的候选基因（图6a, b）。在这些基因中，Spred2被发现是控制ERK信号的负调节剂，而Spred2的m⁶A水平显著降低。m⁶A免疫沉淀（m⁶A-IP）和qPCR证实了Spred2是m⁶A调控的靶基因。KO BMDM和TAM中SPRED2蛋白表达降低，而mRNA水平没有明显改变。mRNA衰减分析表明，m⁶A修饰不会明显影响Spred2的衰减（图6c-g）。

为了研究在Mettl3缺失的BMDM中SPRED2蛋白表达的下调的原因，作者假设其可能是由于YTHDF1控制的蛋白翻译效率的差异所致。通过多核糖体谱分析将分离出的RNA从WT和KO BMDM中分离为非翻译部分和翻译活性多核糖体。qPCR显示，Mettl3缺陷型BMDM的翻译活性多核糖体中的Spred2 mRNA水平显着低于WT BMDM的Spred2 mRNA水平（图6h, i）。接下来，作者为了测试METTL3是否被募集到Spred2启动子并影响Spred2表达。因此作者使用了一个报告系统，该系统由一个在萤火虫荧光素酶基因上游具有Spred2启动子片段的质粒组成。同时为了直接解决METTL3对SPRED2的翻译的催化活性的要求，作者在BMDM中过表达了WT METTL3或mut METTL3。结果表明METTL3的催化活性在SPRED2的翻译中起着至关重要的作用，而与启动子的结合无关。

紧接着研究CDS中的m⁶A甲基化是否可以调控SPRED2的表达，作者分析了人类和小鼠SPRED2保守的m⁶A基元，并将两个可能保守的m⁶A基元GGAC分别突变为GCTC (SPRED2 -CDS mut1或SPRED2 -CDS mut2)或同时突变为GCTC (SPRED2 -CDS mut1/2)。结果显示Spred2-CDS mut2和Spred2-CDS mut1 / 2降低了SPRED2的水平，但Spred2-CDS mut1并未降低，这表明Spred2-CDS mut2中的m⁶A基序是表达调控的主要位点。RNA-IP分析表明与WT BMDM相比，在缺乏Mett13的BMDM中，YTHDF1和Spred2之间的结合显着降低了（图6j-l）。

图6

六、巨噬细胞中的Mettl3缺失削弱了B-1肿瘤中PD-1阻断治疗的疗效

为了评估靶向METTL3激活抗肿瘤反应的潜力，作者在B16肿瘤转移模型中测试了抗PD-1治疗。发现KO小鼠中的B16肿瘤对抗PD-1治疗的反应较弱，表现出肿瘤生长和肺转移大大增加，并且生存期缩短（图7）。这表明缺乏Mettl3的髓样细胞促成B16肿瘤对抗PD-1治疗的耐药性。

图7

总结

综上，这项研究结合MeRIP-seq、m⁶A-IP-qPCR、scRNA-seq等技术手段探究了甲基转移酶METTL3的髓样特异性缺失对小鼠肿瘤的生长和转移的影响，表明Mettl3缺失的巨噬细胞通过调节细胞因子应答来重塑肿瘤微环境。并研究了m⁶A在巨噬细胞重编程中的作用，接着确认YTHDF1在m⁶A调节的SPRED2表达中的作用，以及靶向METTL3激活抗肿瘤反应的潜力。该研究表明巨噬细胞中的m⁶A甲基化酶是潜在的癌症治疗靶标，为靶向治疗癌症提供了新的思路。

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