单细胞用户文章绘制了食蟹猴多器官细胞图谱｜单细胞多组学专题

期刊名称：Nature Communications

发表时间：2022

所用组学：单细胞转录组和单细胞ATAC测序

一、研究背景

非人类灵长类动物(Non-human primate, NHP)在遗传、器官发育、生理功能、病理反应和生化代谢等方面与人类具有相似的特征。因此，NHP作为医学研究和药物开发的实验动物模型具有极大的应用价值。由于细胞是所有生命的基本单位，直接比较生物体之间具有相似功能的器官中的细胞特性和细胞类型组成将有助于将灵长类动物的知识转移到医学研究中。在这方面，了解像食蟹猴(Macaca fascicularis)这样的灵长类动物模型中器官的细胞组成和异质性至关重要。

二、实验设计

单细胞ATAC和单细胞转录组测序：雌性/雄性食蟹猴16个组织器官。

实验设计

三、研究结果

1、单细胞多组学绘制食蟹猴多器官细胞图谱

基于t-SNE的无监督聚类鉴定出包括上皮细胞、纤毛上皮细胞、间充质细胞、免疫细胞、内皮细胞、精子细胞和分泌细胞群。这些细胞可以被注释为40个不同的Clusters（图1b）。

图1：食蟹猴16个器官的单细胞图谱

Tips：上图可通过联川星云绘制

基于标记基因启动子区域的染色质可及性对scATAC-seq数据进行t-SNE聚类分析，鉴定出10种主要的细胞类型（图1d）。此外，作者还发现scRNA-seq和scATAC-seq数据鉴定的细胞类型高度一致，有10个ATAC簇与RNA簇一对一相连（图1e）。

图1：食蟹猴16个器官的单细胞图谱

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2、跨器官的主要细胞类群异质性和动力学

上皮细胞在整合的转录组细胞图谱中占最大的部分。因此，作者首先对上皮细胞进行了细胞亚群分析（图2a）。根据标记基因表达的独特模式，鉴定出包括基底细胞、分泌细胞、纤毛细胞和非纤毛细胞等14种上皮细胞簇（E01-E14）（图2a，b）。分泌细胞多见于脾、肾、结肠、子宫等表皮或实质器官(图2c)。

在各种组织中也有很大比例的纤毛上皮细胞(图2c)，为了探讨纤毛上皮细胞亚型的发育和功能动态，拟时许分析的结果表明，在所研究的器官中观察到纤毛上皮细胞的类似的发育轨迹，从祖细胞样细胞状态分化为成熟状态（图2e），这表明纤毛上皮细胞在不同的器官中可能有共同的分化轨迹。且其中高表达基因主要富集在代谢过程、细胞对刺激的反应和防御反应相关的通路中（图2f，g）。

图2：上皮细胞的异质性和发育状态

Tips：上图可通过联川星云绘制

图2：上皮细胞的异质性和发育状态

Tips：上图可通过联川星云绘制

基质细胞是机体组织的重要组成部分。在对基质细胞进行细胞在分群分析时，一共鉴定到11个Clusters（S01-S11），包括内皮细胞、成纤维细胞、FibSmo细胞和平滑肌细胞四种主要的细胞类型，且具有组织器官异质性（图3a-d）。RNA速率分析揭示了成纤维细胞可能具有向平滑肌细胞和内皮细胞分化的能力（图3f-h）。成纤维细胞高表达参与胶原代谢或胶原分解代谢过程的基因（图3i）。因此，成纤维细胞（S06）的高潜在代谢能力可能有助于合成和分泌胶原蛋白。

图3：不同器官基质细胞的异质性

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免疫细胞对维持体内稳态至关重要。从所研究的器官中鉴定出了72284个免疫相关细胞，包括B细胞、T细胞和髓系细胞。根据已知或新的特征基因，免疫相关的细胞被进一步分为13个主要簇（I01-I13）（图4a，b）。在不同的器官中，免疫细胞的相对比例差异很大（图4c，d）。

图4：食蟹猴的免疫细胞异质性

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3、细胞互作分析

进一步的作者采用CellPhoneDB解读了不同器官中细胞间通信状态。观察到基质细胞、上皮细胞和髓系细胞之间存在着很强的细胞间相互作用（图5a，b）。细胞间相互作用的强度和模式是器官特异性的（图5c）。因此，作者绘制了不同器官的特定细胞亚群中之间的配体-受体对（图5d）。“CD99-PILRA”配体-受体对在基质细胞和髓系细胞之间的相互作用中具有特异性，特别是在脂肪、主动脉和结肠中。“CCL4L2-VSIR”对只发生在髓系细胞和T细胞的相互作用中。“LGALS9-CD44”对参与了大多数免疫细胞相关的相互作用。综上所述，这些结果揭示了食蟹猴各种器官中细胞-细胞通信的潜在分子机制。

图5：细胞间通信网络的动态变化。

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4、食蟹猴主要器官的单细胞ATAC图谱

基于簇特异性顺式元素一共鉴定到22个不同的Clusters（图6a），在所有Clusters中检测到397773个顺位元素，每个细胞簇中有3046到75001个peaks（图6b）。大多数顺式调控元件（CREs或ATAC peaks）来自于启动子、内含子或远端基因间调控区域。大多数Clusters是器官特异性的（图6c），簇特异性CREs相应地表现出器官特异性的可及性(图6d)，这表明不同的细胞类型和器官具有不同的染色质图谱。

图6：食蟹猴主要器官的单细胞染色质景观

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scATAC-seq和scRNA-seq数据的比较分析，显示出Clusters染色质可及性和基因表达的一致模式（图6f）。POU2F2一种B细胞特异性TF，通过调节B细胞的增殖和分化来参与细胞免疫反应，在B细胞簇中增加（图6f）；TCF21是成纤维细胞发育过程中的重要调节因子，在成纤维细胞簇中增加；以EGFL7的基因位点为例，作者还观察到内皮细胞簇中其启动子处的增强子-启动子连接增强。这一结果与EGFL7作为内皮特异性在发育过程中主要由血管内皮细胞产生的内皮特异性分泌因子的作用相一致。

图6：食蟹猴主要器官的单细胞染色质景观

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为了探索特定器官中的基因调控程序，作者采用ArchR分析了结肠中的基因可及性和基因表达数据(图7a-c)。有9种细胞类型的预测结果精准。单核细胞和循环B细胞仅存在于单细胞转录组的结果中。此外，还发现大多数ATAC peaks (CREs)在细胞簇之间表现出不同的可及性，证实了不同细胞类型中不同的染色质景观。Motif分析显示，不同的TF结合Motif在细胞簇间的富集程度不同，其中HNF4A和HNF4G的Motif富集差异最大。

图7：结肠中scRNA-seq和scATAC-seq数据的综合分析

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接下来，将motif活性与相应TF的表达水平相关联，根据TF的表达与其motif富集程度是正相关还是负相关，系统推断出控制结肠发育的TF是阳性还是阴性。前30个代表性激活因子的表达与染色质开放区域的可及性及其结合基序富集密切相关（图7f-g）。scATAC-seq数据为发现食蟹猴的细胞类型和调控DNA提供了丰富的资源。

图7：结肠中scRNA-seq和scATAC-seq数据的综合分析

5、细胞类型特异性和器官特异性的转录基因调控网络

为了系统地推断细胞类型和器官特异性转录调控网络，作者应用SCENIC基于共表达和motif富集来识别TF调控。根据调控活性评分，识别出的TF调控基因具有高度的细胞类型或器官特异性（图8a-d）。最后，将具有代表性的TF调控基因及其相关靶基因组织成细胞类型特异性或器官特异性的基因调控网络（图8e）。

图8：器官特异性转录调控网络

在细胞类型特异性基因调控网络中，观察到CREM特异性控制精子细胞中与增殖相关的靶基因如DAZL和HEY2；在器官特异性基因调控网络中，我们发现ZNF770和CTCF的靶基因在舌头中有特异性表达。ets因子与前/未成熟-B TFs正调控基因在心脏和肌肉中表现出活性升高（图8e）。

为了进一步证实基于scRNA-seq数据的器官特异性TF调控基因的无偏性推断（图8d），使用chromVAR45在含有特定TF结合基序的顺式元件上测量染色质可及性，并分析了上述器官特异性TF结合位点的可及性变化。TF偏差评分显示出与调节活动评分相似的器官特异性模式（图8f-g）。ONECUT1的调节活性和TF偏差评分都是肝脏特异性的（图8g）。这些分析强调了在单细胞水平上对器官特异性基因调控网络的无偏性预测。

图8：器官特异性转录调控网络

5、人类、小鼠和食蟹猴的细胞图谱比较

最后，作者整合了非人灵长类食蟹猴，小鼠和人及其与之匹配组织器官的单细胞数据。整合的细胞图谱包含了15种细胞类群（图9a和b）。此外通过对细胞占比变化分析发现，某些免疫细胞在不同物种间存在一定的差异性（图9d）。单核细胞是一种罕见的细胞，只在食蟹猴中检测到。但不同物种间，标记基因及整体转录本的表达模式相似（图9e和f），且主要细胞群的基因表达模式在所有3个物种中是保守的（图9g）。食蟹猴和人之间的同源基因表达显著高于其他组之间的（图9h）。这些发现表明，食蟹猴在免疫系统中与人类具有高度相似的转录程序。

图9：在人类、小鼠和食蟹猴的单细胞图谱的比较

Tips：上图可通过联川星云绘制

图9：在人类、小鼠和食蟹猴的单细胞图谱的比较

Tips：上图可通过联川星云绘制

最后，作者探讨了三个物种之间细胞间通信的保守和分化模式。通过CellPhoneDB对每个器官中的每一对细胞类型进行了细胞间配体-受体相互作用。不同物种间细胞相互作用的频率呈正相关，这表明这些物种通常共享共同的细胞间信号通路，介导细胞间的通信（图10b）。与人类和小鼠之间的交互模式相比，人类和食蟹猴之间的整体细胞间相互作用模式更相似。事实上，在所研究的器官中，如肾脏和脾脏中，人类和食蟹猴之间的免疫相关细胞-细胞相互作用组和相应的配体-受体对的相互作用强度更为一致（图10c，d）。相比之下，非免疫细胞之间的细胞相互作用更倾向于食蟹猴和小鼠之间的更一致。

图10：人类、小鼠和食蟹猴中保守和分化的细胞-细胞相互作用

Tips：上图可通过联川星云绘制

图10：人类、小鼠和食蟹猴中保守和分化的细胞-细胞相互作用

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四、总结

非人类灵长类动物是一种很有吸引力的实验动物模型，它可以准确地反映人类的发育和病理特征。作者通过单细胞ATAC和单细胞转录组测序数据，绘制了食蟹猴多器官的细胞图谱。集成的细胞图谱能够在多个组织和器官中对分子动力学、细胞类型组成和细胞异质性进行深入解剖和比较。拟时序和细胞互作分析，揭示了细胞发育过程中关键的分子特征。此外，作者还鉴定了各种细胞特异性的顺式调控元件，并在单细胞水平上构建了器官特异性的基因调控网络。最后，通过对比小鼠、食蟹猴和人类之间的单细胞数据，结果表明食蟹猴在免疫相关基因表达模式和与人类的细胞通信方面的相似性明显高于小鼠。综上所述，该研究为非人类灵长类动物细胞生物学提供了宝贵的资源。

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