蛋白组学·2018文献阅读大赛：蛋白质组学如何破解铜绿假单胞菌耐药性机制？
“蛋白组学·2018”线上文献阅读大赛开赛以来，陆续收到了很多参赛作品。经过评审团队精心的审阅、筛选后，精选出6篇优秀参赛作品，参赛作品将陆续在“精准医学与蛋白组学”学术平台发布。
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参赛者：李长富 老师，西北农林科技大学。
参赛作品：科研利器-蛋白质组学如何破解铜绿假单胞菌耐药性机制？
编者按：铜绿假单胞菌（P. Aeruginosa）是一种常见的条件致病菌，能造成院内呼吸道感染、伤口感染及囊性纤维化病人肺炎等感染性疾病。由于铜绿假单胞菌具有先天和后天获得耐药性，其对多种抗生素包括碳青霉烯类抗生素的耐药率不断上升，临床治疗越来越困难。
铜绿假单胞菌主要有四种耐药机制：①产生抗生素灭活酶或修饰酶；②通过改变抗菌药物作用的靶位，以逃避抗菌药物的抗菌作用；③膜屏障与主动外排作用，以限制药物到达其作用靶位；④形成生物膜，使抗菌药物不能有效地到达作用部位。
蛋白质的功能在铜绿假单胞菌耐药机制实现过程中是不可或缺的，比如机制①中提到的抗生素灭活酶和修饰酶本身都是蛋白质（β-内酰胺酶），机制②中抗菌药物的作用靶点本身也是菌体内具有重要功能的蛋白质，机制③中一些抗生素外排蛋白质过表达就是耐药性根源之一，机制④中生物膜的形成更是相关蛋白质发挥功能的产物。
蛋白质组学能够帮助我们全面了解细胞或组织中蛋白质丰度、互作和翻译后修饰等信息，是研究生命活动分子机制的重要技术手段。那么如何利用蛋白质组学揭示细菌耐药性机制呢？接下来两篇Nature Communications 或许能给我们一些启示。
1.铜绿假单胞菌耐药性与宿主适应的进化权衡（NAT COMMU，2018）
2.铜绿假单胞菌生物膜中抗生素耐药菌群的选择性标记和根除（NAT COMMU，2016）
2018年国际专业学术期刊Nature Communications 报道发现铜绿假单胞菌的pmrB突变体对抗生素更加敏感，但其对呼吸道上皮细胞的粘附力、对溶菌酶的耐受性以及对宿主CFTR表达的抑制都增强了，提高了铜绿假单胞菌在早期感染过程中的适应性。这是一种进化权衡的现象。
研究思路与结果
1、 pmrB 功能缺失的突变导致溶菌酶的耐药性
嗜中性粒细胞的脱粒作用能够释放抗菌肽和酶，中性粒细胞是抵御呼吸道细菌感染的主要手段。为了确定pmrB突变对细菌嗜中性粒细胞杀伤作用敏感性的影响，作者分别用人或小鼠的嗜中性粒细胞处理人源或鼠源的P. aeruginosa（人源：LESB65和LESB65 △pmrB；鼠源：pmrB SNP和pmrB WT），发现带有pmrB突变的铜绿假单胞菌对嗜中性粒细胞的杀伤作用的抵抗显著增强（图1-1）。
作者用抗菌肽（β-defensin 2或mCRAMP）和溶菌酶做了类似的实验，发现带有pmrB突变的铜绿假单胞菌对溶菌酶的耐受能力显著增强，对抗菌肽的抗性无显著影响。
图1-1 pmrB功能缺失的突变导致溶菌酶的耐药性
a（b）：人（小鼠）嗜中性粒细胞处理下pmrB 各株系P. aeruginosa 的CFU值；c：溶菌酶处理对pmrB 各株系P. aeruginosa 的OD值的影响
2、 pmrB突变体抗生素敏感性增强
pmrAB系统的突变之前被认为与抗生素耐药性的变化有关。为了确定pmrB突变在赋予P. aeruginosa 溶菌酶抗性的同时是否也影响其对抗生素的耐药性，作者进行了最小抑制浓度(MIC)分析，结果表明，具有pmrB 突变的分离株，对7种常用抗生素敏感性都显著增强（图1-2）。
3、 pmrB突变体蛋白质组学分析
pmrB突变体表型的两个变化，增强了对溶菌酶的耐药性和对抗生素的敏感性，这表明pmrB 突变可能导致细菌基因和蛋白质表达的显著变化。
为了解释这个问题，作者对液体培养的LESB65和ΔpmrB进行了蛋白质组学分析。总共鉴定了216个显著差异蛋白质，其中包括PmrAB双组分调节系统中2个蛋白质，60%(129/216)的差异蛋白质在ΔpmrB株中富集。
①与抗生素耐药性有关的蛋白质在△pmrB中相对丰度较低，比如CprA、MexE以及多个arn基因座的蛋白产物。②与吩嗪合成相关的蛋白质在△pmrB中相对丰度较低。③双组份系统蛋白质在△pmrB中丰度显著降低。④脊椎动物溶菌酶抑制剂蛋白（Ivy）、CFTR抑制蛋白质和Type IV pili蛋白质等在△pmrB中丰度显著增加。
4、 pmrB突变体具有更强的定殖能力
ΔpmrB的囊性纤维化跨膜电导调节(CFTR)抑制蛋白质Cif比LESB65高5.65倍，同时ΔpmrB的脊椎动物溶菌酶抑制剂蛋白（Ivy）比LESB65高2.66倍（图1-3）。qPCR也发现cif在ΔpmrB和pmrB SNP中表达增加。
为了确定Ivy和Cif是否对P. aeruginosa在体内的定殖和生存有作用，作者将突变ivy或Cif的突变体与亲本株在小鼠吸入感染模型中进行了感染能力比较，发现cif或ivy的缺失降低了P. aeruginosa的定殖潜力，证明了Cif和Ivy能够促进P. aeruginosa的定殖和慢性感染（图1-4）。ΔpmrB中Cif和Ivy丰度更高，可能具有更强的定殖与慢性感染能力。
a、cif和ivy突变体与wt亲本肺部感染CFU结果；b、cif和ivy突变体与wt亲本鼻咽感染CFU结果
5、 pmrB突变体的呼吸道粘附能力增强
ΔpmrB 中参与Type IV pili蛋白生物合成的蛋白质丰度显著增高。IV型纤毛不仅在介导细菌在宿主表面的粘附和运动方面发挥着重要作用，在环境感知和毒性方面也发挥着重要作用。通过人肺泡上皮细胞A549和人咽上皮细胞的细菌粘附/入侵检测发现：ΔpmrB-上皮细胞共培养体系中粘附细菌的比例明显高于比LESB65-细胞共培养体系（图1-5）。由此可见，pmrB突变增强了细菌的呼吸道粘附能力。
图1-5 呼吸道上皮细胞细菌粘附实验结果
6、 pmrB SNP与pmrB缺失突变体比较蛋白组学
作者通过体外实验数据发现，pmrB的缺失突变能够还原pmrB SNP的表型。同时，LESB65、pmrB SNP和ΔpmrB三个菌株的比较蛋白组学数据也证实了这一点：在主成分分析中，两个pmrB突变株（pmrB SNP和ΔpmrB）聚类在一起，而远离LESB65（图1-6）。
图1-6 LESB65、pmrB SNP和ΔpmrB三个菌株的比较蛋白组学主成分分析
总结：作者通过蛋白质组学技术等方法对pmrB突变进行研究，建立了pmrB突变增强早期感染潜力的模型（图1-7）：
pmrB突变可能通过如下方式提高铜绿假单胞菌早期感染的能力：①突变导致Cif丰度增加，对宿主CFTR抑制作用增强，进而调节宿主环境使其利于细菌生存。②突变导致type IV pili蛋白上调，增加细菌对呼吸道上皮细胞的粘附与定殖能力。③突变提高Ivy丰度，细菌对溶菌酶耐受性增强。
在早期感染过程中P. Aeruginosa通过牺牲抗生素耐药性，提高溶菌酶抗性为细菌早期的定殖与生存提供有利的宿主环境，同时建议在临床感染早期施加抗生素治疗，因为此时细菌对抗生素更敏感
2016年，国际专业学术期刊Nature Communications上发表了名为“Selective labelling and eradication of antibiotic-tolerant bacterial populations in Pseudomonas aeruginosa biofilms”的研究论文。研究者利用蛋白质组学方法定量分析了铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）生物膜中耐粘菌素亚群的差异蛋白质，发现耐受粘菌素亚群形成与群体感应QS和细胞迁移密切相关。还发现大红霉素与粘菌素配合使用能够促进生物膜的清除，为设计更有效的生物膜相关感染治疗方法指明了研究途径。
研究思路与结果
1、 P. Aeruginosa生物膜中形成粘菌素耐药亚群
文章中研究者结合共聚焦图像采集和活细胞计数，实时监测粘菌素处理后的P. Aeruginosa生物膜中活亚群和死亡亚群，发现活着的耐粘菌素亚群能够迁移到死亡亚群的顶部，推测这种迁移可能涉及特定信号的协调过程。
图2-1 生物膜中产生耐粘菌素亚群并向死亡亚群迁移
a、耐粘菌素亚群（绿色）向死亡亚群（红色）迁移；b、粘菌素处理下细胞计数分析，cfu先减少后增加
DNA测序结果表明，与对照亚群相比耐粘菌素亚群并没有发生非同义突变，且耐粘菌素亚群在不含粘菌素培养基过夜培养后，对粘菌素抗性丧失，说明生物膜中产生的耐粘菌素细胞仅表现为pmr操作子的短暂表达，而不是基因变异引起的。
2、SILAC蛋白质组学研究粘菌素耐受亚群新表达蛋白质丰度
为了深入了解耐粘菌素亚群定向运动和形成的过程，作者采用pulsed-SIALC定量蛋白质组学方法，研究高剂量粘菌素处理后，耐粘菌素亚群的新蛋白丰度。鉴定出4250个P. Aeruginosa蛋白质，并对其中差异表达蛋白质进行了功能分类（图2-2）。
图2-2 耐粘菌素亚群差异蛋白质功能分类
2、 Pili和QS可导致粘菌素耐受性
蛋白质组学数据显示参与组装type IV pili的蛋白质如PilF在耐粘菌素亚群中高水平表达。作者推测耐粘菌素亚群的迁移需要type IV pili蛋白质。Type IV pili突变体ΔpilA生物膜中耐粘菌素亚群迁移率下降，基因回补之后表型恢复。这一结果证实了作者的推测。
图2-2 type IV pili突变影响耐粘菌素亚群的迁移
（PAO1为野生型，ΔpilA为突变体，ΔpilA/pDA2为回补型；红色为死亡亚群，绿色为耐受亚群）
另外，作者发现QS（群体效应）调控蛋白，包括LasB、几丁质酶和吩嗪/嘧啶合成蛋白(Phz)，在耐粘菌素亚群中都有高表达。众所周知，QS在生物膜中协调群体行为，因此作者推测QS在生物膜中协调耐粘菌素亚群的形成。QS无效突变体ΔlasIΔrhlI，在粘菌素处理下形成较少的耐受亚群，化学回补之后形成耐受亚群的表型恢复。这一结果证实了作者的推测。
图2-3 QS突变体影响新的耐粘菌素亚群形成（ΔlasIΔrhlI为QS突变体）
作者还发现：同时突变QS和pili的突变体△pilA△lasR△rhlR的生物膜中几乎不形成耐粘菌素亚群（图2-3）。足以说明QS与type IV pili对于耐粘菌素亚群形成的重要性。
图2-4 野生型和pili突变体耐粘菌素亚群中lasB-GFP融合表达结果。PAO1为野生型，ΔpilA为突变体
lasB-GFP在野生型耐粘菌素亚群中高度表达，而在type IV pili突变的耐粘菌素亚群ΔpilA中不表达（图2-4），这与蛋白组数据一致，即LasB和嘧啶合成蛋白在耐粘菌素亚群中高表达。说明在粘菌素耐药亚群中，IV型pilii介导的迁移发生在QS的激活之前。
3、 用化学方法清除粘菌素耐受亚群
因为IV型pili介导的迁移和QS对于P. Aeruginosa生物膜中耐药亚群形成是所必需的（图2-3），作者尝试了一些化学生物学方法旨在清除耐粘菌素亚群。大环内酯（如红霉素）可抑制P. Aeruginosa中IV型pili组装和QS，因此红霉素与粘菌素联合使用应可清除P. Aeruginosa耐受亚群。作者借助一系列验证实验证明了这种疗法的有效性（图2-5）。
图2-5 红霉素与粘菌素配合使用清除耐受亚群
（Colistin是粘菌素；Erythromycin是红霉素；红色为死亡亚群，绿色为耐受亚群）
总结
作者根据蛋白质组学结果以及后续实验的验证，整理出如下模型用于研究P. Aeruginosa 生物膜上的耐粘菌素亚群的形成机制（图2-6）：
图2-6 粘菌素耐受亚群形成过程
由图可见，P. Aeruginosa 生物膜中耐粘菌素亚群的形成大致可分为这几个过程：①抗生素如粘菌素杀死生物膜中大多数细菌；②存活的抗生物耐受细菌过表达IV型pili，促进耐受亚群（绿色色）向死亡亚群（红色）的顶部迁移；③产生QS调控因子，促进新耐药菌群的形成。
第一篇文章发现在早期感染过程中P. Aeruginosa通过牺牲抗生素耐药性，提高溶菌酶抗性为细菌早期的定殖与生存提供有利的宿主环境，同时建议在临床感染早期施加抗生素治疗，因为此时细菌对抗生素更敏感；
第二篇文章则发现在P. Aeruginosa形成生物膜之后，细菌在抗生素治疗下会产生耐药亚群，耐药亚群向生物膜顶部迁移，同时通过群体效应QS调控更多新的耐受亚群形成以削弱抗生素治疗效果。同时建议在临床使用红霉素与粘菌素联合使用疗法清除抗性亚群。
综合两文可以得到这样的启示：在铜绿假单胞菌感染早期就利用红霉素与粘菌素联合治疗方法，可在感染早期有效杀伤细菌，又能切断耐药亚群形成机制，从而根治感染。
在技术方法上，两篇高水平文章都采用蛋白质组学获取文章的主要数据，以组学数据为线索结合一系列功能实验，针对性解答组学数据与表型相关联的机制，既不落纯组学类文章的俗套，也避免了纯推测类文章的盲目性，极大提升paper的故事性和条理性。
参考文献
1、 Bricio-Moreno L, Sheridan V H, Goodhead I, et al. Evolutionary trade-offs associated with loss of PmrB function in host-adapted Pseudomonas aeruginosa[J]. Nature Communications, 2018, 9(1): 2635.
2、 Song L C, Yam J K H, Hao P, et al. Selective labelling and eradication of antibiotic-tolerant bacterial populations in Pseudomonas aeruginosa biofilms[J]. Nature Communications, 2016, 7(10750):10750.
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