解组归“甜”，ChemComm | 田志新组/陈芸组开发出新方法应用于乳腺癌干细胞的N-糖蛋白标志物筛查
景杰学术/解读
癌干细胞（Cancer stem cells，CSCs）是一小群干细胞样细胞，其特征在于它们不但能够自我更新、分化和诱导肿瘤发生，同时还负责肿瘤的扩张、突变积累、治疗抗性、转移和复发。乳腺癌是女性的主要癌症，寻找乳腺癌干细胞的标志物对于开发治疗药物是不可或缺的。异常的蛋白质糖基化修饰与肿瘤的发展和进程有很大关系。尽管很多CSCs的标志物是糖基化修饰异常的糖蛋白，但目前仍没有针对单一癌症类型的特异性标志物。
2019年6月，同济大学化学科学与工程学院的田志新课题组与南京医科大学药学院的陈芸课题组合作，在国际期刊Chemical Communications（IF：6.164）上在线发表了乳腺癌干细胞标志物的相关研究成果。作者利用新开发的位点和结构特异性同位素标记定量N-糖基化蛋白质组学方法，对乳腺癌癌症干细胞进行了研究，在完整N-糖肽水平上实现了潜在N-糖基化标志物的位点和结构特异的组学高通量鉴定，一次性获得了144个差异表达的完整的N-糖基化肽段。该结果与单独使用蛋白质、RNA或DNA的生化测量结果具有良好的一致性。
在本研究中，作者开发出一种新的搜库引擎“GPSeeker”，搭配稳定同位素二乙基标记（SIDE），对MCF-7癌干细胞以及MCF-7细胞之中完整的N-糖基化肽段进行了有效地鉴定和定量。研究不仅有助于新标志物的发现和早期检测，还有助于深入理解糖基化改变在肿瘤侵袭和靶向治疗中的作用。
研究者选择MCF-7癌干细胞（以下称“MCF-7 CSCs”）以及MCF-7细胞（以下简称“MCF-7”）为研究对象，通过ZIC-HILIC富集和SIDE标记后，将“MCF-7”和“MCF-7 CSCs”中的完整的N-糖基化肽段以1∶1的比例混合，然后使用液质联用串联质谱仪（C18-RPLC-nanoESI-MS/MS ）进行分析，共鉴定出2558个完整的N-糖基化肽段，对应727个N-糖基化位点，724个特异性肽段和640个完整的N-糖蛋白（图1，左侧），以及由53个单糖组成的136个推测的N-糖链。其中高甘露糖型、杂合型和复合型的N糖基化占比分别为81.35%、3.95%和14.7%。在2558个完整的N-糖基化肽段中，有1461个的糖形分数≥1，这表示在每个肽段的匹配片段离子中，能够识别出一个以上的N-糖链结构诊断离子。
作者利用GPSeekerQuan搜索了2558个完整的N-糖基化肽段的丰度。在三次技术重复中，352个肽段至少被定量一次，185个肽段至少被定量两次。进一步根据差异倍数绝对值≥1.5倍和p<0.05的标准，获得了144个差异表达的完整的N-糖基化肽段（图1A）。其中在“MCF-7 CSCs”下调的肽段91个（其中8个被报道过），对应30个N-糖蛋白；上调的肽段53个（其中7个被报道过），对应16个N-糖蛋白（图1B）。
图1、A、鉴定到的完整的N-糖基化肽段（FDR≤1%；左上）和差异表达的N-糖基化肽段（差异倍数绝对值≥1.5倍，p < 0.05；左下）；B、完整的N-糖基化肽段的火山图。
在“MCF-7 CSCs”中上调幅度最大的蛋白为CD13，其次是ATL3、CJ090、DMD、MOXD2、LAMP1、GT251、STT3A、CF089和GCFC2。下调幅度最小的蛋白是TBL2，其次是EIF3L、EVI5L、CH037、ZC3HD、LPAR5、LRP5、N4BP1、DPYL2和M4K3。其中在“MCF-7 CSCs”中，检测到来自脯氨酰3-羟化酶1（P3H1_HUMAN，Q32P28）的第467位点能够发生N-糖基化，对应完整的N-糖基化肽段LLNGSQR-N2H6F0S0表达量下调（图2A）；而来自丝氨酸蛋白酶抑制剂H1（SERPH_HUMAN，P50454）的120位点能发生N-糖基化，对应完整的N-糖基化肽段SLSNSTAR-N2H8F0S0的表达量上调（图2B）。
图2、“MCF-7 CSCs”中下调的N-糖基化肽段LLNGSQR-N2H6F0S0（A图）和上调的N-糖基化肽段SLSNSTAR-N2H8F0S0 （B图）
之前报道过的两个乳腺癌干细胞的N-糖蛋白标志物：CD14和氨肽酶N，在本研究中被有效定量。其中CD14 （P08571，CD14_HUMAN）的151位点在“MCF-7 CSCs“中发生轻微的N-糖基化下调；而氨肽酶N（又名CD13，P15144，AMPN_HUMAN）的234位点发生N-糖基化上调。
而另外五种之前报道过的乳腺癌干细胞的 N-糖蛋白标志物（锌指蛋白GLI1、CD63、CD49F、CD151、CD97），只在个别的技术重复中被定量到。例如仅在“MCF-7 CSCs”的技术重复TR3中鉴定到了GLI1（P08151，GLI1_HUMAN）的344位点发生N-糖基化修饰上调，但该位点的N-糖基化在UniProt数据库中没有从未被注释过。又如仅在“MCF-7 CSCs”的技术重复TR1中，定量到CD63 （P08962，CD63_HUMAN）的130位点发生N-糖基化修饰下调。
作者进一步使用PANTHER分类系统（http://pantherdb.org/），针对“MCF-7 CSCs”中144个差异表达的完整的N-糖基化肽段，进行了基因本体分析，结果显示它们大部分位于细胞或细胞器区域（图3），主要参与细胞和代谢过程；而它们的分子功能主要是结合与催化活性。
本研究提供了一种新的搜库引擎GPSeeker，搭配稳定同位素二乙基标记（SIDE），有助于完整的N-糖基化肽段的鉴定和定量分析。20个已知的CD系列干细胞标志物（CD13、CD14、CD20、CD4、CD90、CD63、CD49F、CD151、CD97、CD44、CD49b、CD109和CD133），13个能够被鉴定、定量或观察到，从而印证了新方法的有效性。
参考文献
Yue Wang., et al, 2019, Site- and structure-specific characterization of N-glycoprotein markers of MCF-7 cancer stem cells using isotopic-labelling quantitative N-glycoproteomics. Chemical Communications.
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