研发 | 手足口病克星--抗肠道病毒71型药物研究进展
随着开学季的到来，除了常态化的疫情防控，手足口病（HFMD）的防治也是幼儿园的重点工作。手足口病临床表现通常为发热，伴有手、足、口腔等部位的疱疹，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。人类肠道病毒71（EV71）是引起婴幼儿手足口病（HFMD）的主要病原体之一。世界各地均有 EV71感染病例的报道，但大规模爆发主要发生在我国以及东南亚国家。目前，临床上防治 EV71 感染缺乏特异、高效的药物，常以对症治疗为主。最常见的抗病毒药物是病毒靶向性药物和宿主靶向性药物，对于抗 EV71 药物而言，研究更多的是针对病毒感染的过程；针对宿主的抗病毒药物，发挥效用多是靶向宿主后借助免疫应答实现。
靶向病毒药物
理论上，病毒生命周期的任何一个步骤都可作为药物抗病毒治疗的潜在靶点。因此，根据病毒的生命周期，靶向EV71 感染的具体过程是抗 EV71 药物治疗的思路之一。
1、阻止病毒的吸附、穿入与脱壳
病毒吸附于宿主表面后，EV71 通过表面衣壳蛋白(Capsid Protein，VP)受体修饰糖基(SCARB2和PSGL-1等)的相互作用来完成吸附过程。因此，合适的糖分子将成为阻断 EV71 表面糖基结合位点的潜在竞争性抑制剂。阿卡波糖作为一种葡萄糖通道抑制剂，可通过阻断病毒表面的受体结合位点或抑制细胞表面的各种糖类受体来降低 EV71 的感染。体外试验发现，同时加入金银花-连翘和病毒组比感染后加入金银花-连翘的作用更强，表明金银花-连翘可能阻止了病毒的吸附和传入。槐果碱是苦参中含量最丰富的生物碱之一，其可通过阻断病毒与细胞的粘附而靶向 EV71 病毒，切断EV71 与宿主细胞的进一步相互作用。
以肠道病毒衣壳结合剂设计并改造的哌嗪新衍生物 VP1-4(用哌嗪取代咪唑啉酮环设计)靶向 EV71 表面衣壳蛋白 VP1，抑制 EV71 的复制。在BPROZ 系列化合物的吡啶环上引入氨基/酰胺基团合成的TJAB1099作为一种高效的抗EV71抑制剂，具有良好的化学稳定性，有学者开发了含 TJAB1099 的体外凝胶剂，能有效抑制 EV71 在体外的传播。随着研究的深入，有研究发现 BTA39 可以显著抑制 EV71 复制的活性，而且这种化合物在动物实验中可口服利用，不过对于该化合物的后续临床试验未见跟进。此外，研究发现，经批准的小儿抗寄生虫药苏拉明的萘三烯酸基团可以与病毒衣壳结合来抑制病毒的附着与进入，阻断 EV71 感染。
2、阻止病毒 RNA 的翻译与复制
由于EV71基因组 RNA的5ʹ端无帽子结构，其翻译起始主要由EV-71基因组5′UTR处核糖体内部进入位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)元件通过 cap 独立机制介导。IRES 是一种顺式作用元件，在翻译和基因组的复制期间，需要翻译起始因子和 IRES 特异性反式作用因子的协助促进翻译的进程，该高度结构化的 5?UTR IRES 位点可作为 EV71的潜在药物靶点。
山奈酚可能改变 FUBP1、FUBP3、HNRPD、HNRH1 和HNRPF 的 IRES 特异性反式作用因子的组成，与高度结构化的 EV71 的 5′UTR结合并抵抗 EV71 感染。从医学应用的角度来看，一种有效的抗 EV71 治疗药物应该特异性地抑制病毒 IRES，而不影响真核启动子区域的活性，咖啡酸衍生物紫草酸镁(Magnesium Lithospermate B，MLB)和迷迭香酸(RA)能抑制EV71-IRES 介导的翻译，抑制 EV71 的感染，但对真核 cap 依赖的翻译没有影响。此外，研究证明芹菜素也可干扰病毒 IRES 活性，发挥抗 EV71 作用。
3、抑制病毒非结构蛋白活性
EV71 翻译后的 7个非结构蛋白2A?2C 和 3A?3D 等是参与多种病毒功能的重要元素，包括蛋白酶、ATPase 活性和 RNA 复制等，已使用基于靶点的策略来寻找这些特异性酶抑制剂。EV71的2A 蛋白酶与 3C 蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶，参与 EV71 多聚蛋白的加工。2A 蛋白酶介导 VP1 自身 N 末端和 C 末端的初始裂解，从而区分结构蛋白前体和非结构部分；3C 蛋白酶完成多聚蛋白的后续水解过程，在 EV71 复制和宿主细胞凋亡中起重要作用。因此，以3C 蛋白酶为靶点的抗逆转录病毒药物的开发成为一个热点。Rupintrivir(AG7088)是最初开发的人鼻病毒(Human Rhinovirus，HRV) 3C 蛋白酶的不可逆抑制剂，是迄今为止唯一进入临床试验的 3C 抑制剂。研究表明，其能与 EV71 的 3C 蛋白酶的活性位点共价结合。基于Rupintrivir 与 3C 蛋白酶的共价结合，有学者开发了一系列高抑制性药物，如基于物质的肽模拟物、醛类及氰醇衍生物。肽醛衍生物 NK-1.9k 能够抑制 EV71 3C蛋白酶活性和 EV71 增殖。α-酮酰胺细胞毒性相对较低，可作为 EV71 3C蛋白酶的抑制剂。许多天然化合物对 3C 蛋白酶也有抑制作用。植物中广泛存在的槲皮素可插入 EV71 的 3C 蛋白酶底物结合囊中，阻断底物识别，从而抑制 EV71 3C 蛋白酶的活性。此外，木犀草素、菲西汀和芦丁、白杨素(Chrysin，CR)及其衍生物白杨素-7-磷酸二异丙酯(Diisopropyl Chrysin-7-Yl Phosphate，CPI)等均可抑制 EV71 3C 蛋白酶活性，从而阻断 EV71 的复制。
研究发现，杨梅素有体外抗病毒作用，主要作用机制可能与直接作用于病毒颗粒有关；从海带中提取的 LJ04 可以直接干扰细胞和病毒颗粒之间的结合发挥抗EV71活性。吡哌 啶族化合物，包括Pimprinethine、WS-30581 A 和 WS-30581 B，对 EV71 有稳定的抵抗效应；它们还有轻微的抗 CVB3、HSV-1 和H1N1(除少数外)活性，可以成为抗病毒感染的适宜治疗药物。此外，7-羟基黄酮和磷酸二异丙基黄酮、甘草酸、老鹤草和鱼腥草等天然植物中活性成分与合成药物 AN-12-H5、NITD008 等均有抑制 EV71 复制的活性。
靶向宿主药物
病毒感染宿主的同时，一方面可以诱导抗病原体的天然免疫应答；另一方面还能通过机体水平的宿主反应而发生获得性免疫应答来抵抗病毒的入侵。研究发现，喜树碱 C可通过激活宿主固有免疫抑制 EV71的繁殖，表现出明显的抗病毒活性；穿心莲内酯磺酸盐(喜炎平注射液)可直接作用于激活的嗜中性粒细胞和 T 淋巴细胞，调节其免疫活性，提高机体的免疫力，从而保护小鼠免受致死性 EV71 攻击。此外，采用动物与细胞实验结合的方法，发现喹诺利嗪生物碱可通过补偿降低的 T 细胞水平而有效保护 EV71 感染的小鼠，其中氧化槐果碱效果最显著。
芒柄花黄素可通过调节ERK、p38和JNK等MAPKs途径抑制 EV71 诱导的 COX-2 表达和 PGE2 的产生，从而抑制病毒复制和炎症因子的表达。此外，病毒的刺激可触发 NF-κB 信号通路，从而调节免疫应答和炎症反应等，盐酸去氢骆驼蓬碱可通过抗氧化机制特异性抑制 NF-κB 信号通路的激活，抑制 EV71 复制并减少EV71 诱导的活性氧的产生；类似地，白藜芦醇通过阻断 IKKs/NF-κB 信号通路，抑制炎症反应并减轻 RD 细胞的损伤来有效减轻 EV71 对宿主细胞的感染。异绿原酸C(Isochlorogenic Acid C，ICAC)通过调节谷胱甘肽氧化还原平衡，防止 EV71 感染。此外，载奥司他韦的 SeNPs 在人星形细胞瘤细胞模型中通过线粒体途径抑制 EV71 感染诱导的宿主细胞凋亡，减少活性氧的产生。甘草碱衍生物 LY-55通过抑制自噬来抑制 EV71 和 CVA16 的复制。姜黄素在 Vero 细胞中通过泛素-蛋白酶体途径抑制蛋白质降解，激活细胞外信号调节激酶，在病毒感染的早期阶段显示出其强大的抗凋亡活性。
多途径抗病毒药物
蜜环菌(Melissa Officinalis，MO)是一种在欧洲和中东地区有着悠久历史的药用植物。首先，其提取物中的生物活性成分迷迭香酸(Rosmarinic Acid, RA)可与病毒颗粒结合，干扰其与受体的连接和内化，减少病毒的粘附和进入；其次，RA 在吸附后阶段的抗 EV71 活性更与宿主多种机制有关：RA 抑制 EV71 诱导的宿主细胞翻译的破坏和病毒翻译的启动；真核细胞翻译起始因子4G 的裂解；异质核核糖核蛋白 A1 的细胞质重定位；活性氧的产生，这些结果提示MO 及其成分 RA 具有抗 EV71 活性，可作为治疗和预防 EV71 感染的候选药物。此外，荆芥水提物(Extract of Schizonepeta Tenuifolia Briq，STE)也通过作用于多个靶点对 EV71 产生抗病毒作用。黄芩苷和小檗碱对 EV71 感染具有很强的抗病毒作用。黄芩苷对病毒与宿主存在双重作用，可通过抑制 EV71/3D 聚合酶表达和激活 Fas/FasL 信号通路来实现，而且靠阻断/下调 NF-κB 信号通路减少细胞因子的分泌；小檗碱以剂量依赖性发挥作用，通过下调 MRK/ERK 信号通路和 EV71 诱导的自噬表达来抑制 EV71 的活性。
近些年，以 EV71 感染引起的手足口病在许多亚洲国家的频繁暴发，迫切需求有效的抗病毒 药物。2018 年，国家卫生健康委员会发布的《手足口病诊疗指南( 2018 版)》指出，α干扰素、利巴韦林的早期使用有一定的抗病毒疗效，但目前临床仍缺乏治疗EV-A71 感染的有效手段，因此，努力开发安全有效的抗病毒药物至关重要。
参考资料
[1]乔俊华,孙欣,王盛羽,宋鸿.抗肠道病毒71型的药物研究进展[J/OL].微生物学通报:1-16[2021-09-06].https://doi-org-443.e1.buaa.edu.cn/10.13344/j.microbiol.china.210299.
[2]孙建东,陶臻.肠道病毒71型抗病毒药物的最新研究进展[J].医学综述,2020,26(05):980-985.
作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证
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