RNA-Seq发文章越来越难？只因你不知道这2个公式+1个秘诀

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RNA-Seq发文章越来越难？只因你不知道这2个公式+1个秘诀

原创 2017-09-13 赵青华大科技BGITech

许多小伙伴都表示现在发RNA-Seq文章似乎是越来越难了，可同样是发文章，为什么总有人很轻松？影响因子还很高？那咱们就看看最近别人发了什么样的文章！

近期BGISEQ-500 RNA-Seq发表文章一波又一波，影响因子3分起（还有8分多的哦），科技君从中看破2个发文章公式！文末还有1个秘诀？

发文套路

表1 BGISEQ-500 RNA-Seq 2016-2017年部分发表文章

是不是隔着屏幕都嗅到了套路的气息？科技君将这些概括成一个BGISEQ-500 RNA-Seq发文套路公式：

公式1：发文套路公式

发文套路公式= (实验组+对照组) ×

生物学重复数+RNA-Seq数据挖掘+验证

公式解释：（实验组+对照组） ×生物学重复数：如果实验组和对照组一共4个样本，做3个生物学重复，则样本数是4×3=12个；建议生物学重复数至少3个。

RNA-Seq数据挖掘：找到关键基因、功能和通路

验证：再做10个左右的qRT-PCR技术验证，推荐继续做功能验证，如果要发表高分文章，尤其是疾病研究文章，还需大样本量的验证。

另外，对于无参考序列的物种，混合所有样本做一个转录组de novo组装后作为参考序列。

公式2：样本选择公式

“实验组+对照组”，样本选择要充分考虑基因差异表达来源进行样本选择，科技君也概括了一个样本选择公式：

样本选择公式=空间+时间+条件+

对照-表型

公式解释：

空间：不同的组织、器官、性别；

时间：不同的发育时期/处理时间/疾病发展时期；

条件：不同处理条件，例如剂量梯度；

对照：对照品种或样本，例如野生型、感病/抗病品种、正常与疾病样本；对照处理，例如未处理、阴性处理；

表型：结合表型是关键，找出关键时间点、最佳处理条件，减少盲目设计大量样本。

接下来科技君为大家一一介绍发表文章☟☟☟

文章一

生物学问题

——发现植物防御反应中的关键基因和调控元件

铜离子促进拟南芥乙烯合成，进而引起植物防御反应，RNA-Seq及后期功能验证阐明关键基因和调控元件在铜离子刺激下能够促进合成乙烯中的分子机制。

文章题目： 拟南芥AtACS8基因在铜离子激活下，在乙烯早期生物合成中起关键作用

发表期刊：Journal of Cell Science

影响因子：4.431

发表时间：2017年8月

发文单位： 山东农业大学

摘要：铜离子是所有生物体所必需的，我们之前报道过拟南芥中铜离子能引起防御反应，这依赖于乙烯信号通路，但是、铜离子引起乙烯生物合成的机制仍不清楚。本文中我们发现CuSO4处理后快速提高乙烯合成；另外，它能上调一些防御相关基因的表达，例如一些乙烯合成基因，其中AtACS8是铜离子诱导下，防御反应和早期乙烯合成中必不可少的。而且，铜离子诱导的AtACS8表达，是依赖于AtACS8启动子区的铜响应顺式元件（CuRE）。

结论：铜离子特异性激活拟南芥AtACS8基因表达，来促进乙烯早期生物合成，进而引起依赖于CuRE调控元件的拟南芥防御反应。

主要结果：

1、拟南芥中铜离子促进乙烯合成

发现处理24小时后，CuSO₄处理比MgSO4合成了更多乙烯（图1A），而且在转录水平上乙烯响应因子1，ERF1基因（乙烯合成信号通路的一个标记）表达更多。这些结果说明铜离子促进拟南芥乙烯合成和激活乙烯信号通路。

图1 铜离子提高拟南芥乙烯水平和上调ERF1表达

2、拟南芥CuSO4处理后基因表达差异

2周大野生型拟南芥植株样品，CuSO4处理后0、2、24h，2个生物学重复，共6个样品BGISEQ-500 RNA-Seq，SE50，24M clean reads，Clean Data Rate高达99.95%。（BGISEQ-500 RNA-Seq测序数据质量高！）

表1 测序数据统计

（点击图片查看高清原图）

CuSO4处理后，2小时后2206个上调，1009个下调基因；24小时后2423个上调，590个下调基因（图2A）。快速（2小时）上调基因中，370个基因是被鞭毛蛋白和延伸因子上调（图2B）。qRT-PCR验证上调基因，发现所有挑选基因验证结果与测序相似（图2C）。GO分析发现79.30%的上调基因可以归类于代谢进程，细胞进程和刺激响应。——技术验证测序结果，BGISEQ-500 RNA-Seq定量准确性高！

图2 铜离子调控下拟南芥基因表达情况

3、铜离子激活拟南芥乙烯生物合成通路

通过测序获得CuSO4处理2小时后快速地受诱导的基因中，有一些是参与乙烯生物合成的（图3A），这其中包含了AtACS8等基因。qRT-PCR验证获得的这些乙烯合成基因，发现所有挑选的基因的验证结果与测序相似（图3B）。这些结果说明铜离子诱导了拟南芥乙烯合成基因的表达。——技术验证测序结果，BGISEQ-500 RNA-Seq定量准确性很高！

图3 CuSO4处理后乙烯生物合成通路基因的表达情况

4、铜离子可以迅速地激活乙烯生物合成

通过分析不同时间点的乙烯产率，证明铜离子可以迅速地激活乙烯生物合成。

5、铜离子诱导的防御反应和乙烯合成依赖于AtACS8基因

通过测序和qRT-PCR验证，说明铜离子快速诱导AtACS8表达（图3）。检测野生型和敲出突变植株的MgSO4 或 CuSO4处理后乙烯水平和乙烯合成信号通路的标记基因表达水平，以及更多验证工作，证明AtACS8基因在铜离子诱导的乙烯早期生物合成中起关键作用——功能验证测序结果。

6、鉴定CuRE在铜离子诱导表达AtACS8中的作用

通过构建突变体、定点敲除等方法，证明铜离子诱导的AtACS8表达，是依赖于AtACS8启动子区的铜响应顺式元件（CuRE）——功能验证测序结果。

文章二

生物学问题

——通过动物模型发现人类疾病代谢通路的关键基因和疾病相关通路

抑郁症是一种严重的人类疾病。动物模型果蝇，药物处理引起类似抑郁症表型。RNA-Seq研究基因表达变化和与疾病相关的代谢通路，解释人类抑郁症分子机制。

文章题目：药物引起果蝇类似抑郁症的表型和基因表达谱改变

发表期刊：Brain Research Bulletin

影响因子：3.0329

发表时间：2017年6月

发文单位：华中师范大学

摘要：重度抑郁症（MDD）是一种严重的精神疾病，分子机制目前还不清楚。黑腹果蝇和人在药物作用下有相似的类似抑郁症状表现，因为作为动物模型。发现喂养黑腹果蝇左旋多巴或者氯丙嗪能引起类似抑郁症表型。通过RNA-Seq，发现氯丙嗪处理（CPZ）组与对照组雄性果蝇相比，有467个基因差异表达，其中312个基因上调表达，155个基因下调表达。这些基因参与的代谢通路有帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病和溶解酵素通路。qRT-PCR确定了19个CPZ组与对照组雄性果蝇中差异表达的基因。

结论：药物引起黑腹果蝇类似抑郁症的表型。通过RNA-Seq发现467个差异表达基因，涉及到新陈代谢、人类疾病和溶解酵素通路，提供解释人类抑郁症分子机制的补充观点，可能有助于临床治疗。

主要结果：

1、表型

通过抑郁症类似行为、生物标记和遗传毒性等研究，发现氯丙嗪2000 mg/L，48小时处理引起雄性果蝇更加明显的抑郁症类似的特征，包括显著性降低的食物摄取量、交配频率、血清素（5-HT）浓度和增加的丙二醛（MDA）浓度以及减少的超氧化物歧化酶（SOD）活性，雄性比雌性对药物更敏感。而且，氯丙嗪处理的果蝇，其后代也有这些类似抑郁症的特征。

2、RNA-Seq

（1）为探究抑郁症分子机制，测序6个雄性果蝇RNA-Seq，包含2个组，即3个生物学重复。3个对照组样品，3个CPZ组样品，每个样品包含30个果蝇。

（2）平均24,137,120 raw reads ，过滤后24,100,281 clean reads，clean reads比率高达99.85%。——BGISEQ-500 RNA-Seq测序数据质量很高！

（3）每个样品鉴定到的基因数量。数据库中一共有基因13907个，每个样品鉴定的基因有12702-12898个，鉴定出的基因数占数据库基因总数比例很高，91.34%-92.74%（图1）。

——BGISEQ-500 RNA-Seq基因检测灵敏度很高！

图4. 鉴定到的基因数量

（4）CPZ与对照组的差异表达基因，一共312个显著上调基因和155个显著下调基因（图2）

图5 所有表达基因Scatter-plot分布图

（蓝色代表下调基因、橘色代表上调基因和棕色代表非差异表达基因）

（5）GO分析；GO分为分子功能（MF）、细胞组分（CC）和生物过程（BP）三大功能类，分别分析了三类参与基因最多的功能（图3）。

图6 差异基因GO功能分类

（6）代谢通路分析。在Top20差异基因KEGG富集通路中，鉴定出一些神经性的疾病相关通路，包括帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病（图4）。而且一些其他人类疾病相关通路也展现在图中，比如百日咳、胰液分泌、非酒精性脂肪肝病、刺激神经组织的配体-受体互作、溶解酵素、雌激素信号通路、心肌收缩和抗原加工提呈——数据库对数据功能挖掘十分重要性。华大基因是KEGG数据库唯一授权的中国公司，不断更新的数据库版本，让您紧跟前沿最新信息。

图7 Top20差异基因KEGG富集结果

3、qRT-PCR验证挑选19个基因进行qRT-PCR，挑选原则是差异大的差异表达基因，以及与神经病相关的基因（图5）。19个基因qRT-PCR结果全部都与RNA-Seq相似——BGISEQ-500 RNA 44 34325 44 15289 0 0 2608 0 0:00:13 0:00:05 0:00:08 2728 44 34325 44 15289 0 0 2228 0 0:00:15 0:00:06 0:00:09 2746-Seq定量准确性很高！

图8 qRT-PCR验证RNA-Seq差异表达基因

下面三篇文章已发布过微信，科技君就简要介绍（下方有链接哦）

文章三

生物学问题——发现细菌改造菌株副产物生物合成通路被阻断所影响的基因和代谢通路

丙二醇是一种被广泛使用的化学原料，克雷伯氏菌（K. oxytoca）经基因工程手段改造，高效生产丙二醇。RNA-Seq与传统的生理生化指标测定相互验证补充，为高质量的代谢工程研究提供了基因水平的依据。

文章题目：代谢通路的协同作用：通过耦合光学纯的乳酸生物合成提高1,3-丙二醇生产中的碳平衡

发表期刊：Metabolic Engineering

影响因子：8.201

发表时间：2017年4月

发文单位：上海交通大学、山东大学和华东理工大学

点击下方“阅读原文”即可查看该文献解读

文章四