精准医疗时代下的肿瘤标志物研究进展
寻找用于早期诊断、指导治疗、评估疗效与预后的高敏感度和特异的肿瘤标志物是攻克恶性肿瘤、解决临床诊治难题关键之一。随着精准医疗的发展，肿瘤标志物得到越来越多的关注。
本文综述了近期肿瘤标志物的突破性进展，并指出在临床实践中，肿瘤标志物检测已在肿瘤早期筛查和诊断、指导肿瘤治疗并预测疗效、预测肿瘤复发转移和预后方面发挥重要作用。
近年来，肿瘤标志物的研究内涵逐步扩展，实现了从传统蛋白质肿瘤标志物到肿瘤细胞或基因组标志物的延伸；相应检测技术实现了从静态检测到动态监测，从普通测序技术到高通量测序、单细胞测序乃至人工智能技术的变革。
肿瘤标志物研究内涵逐步扩展
随着组学研究的发展，以及高通量测序、液体活检等高新技术的不断开发，肿瘤标志物的研究内涵逐步扩展。
基于肿瘤基因组和
染色体变异的肿瘤标志物
基于肿瘤基因组和染色体变异的肿瘤标志物与肿瘤的发生发展密切相关，部分已成为肿瘤的常见易患基因、诊断基因/染色体以及预后和治疗疗效监测的预测性标志物。
其中，最常见的是细胞DNA修复途径的改变，包括碱基切除修复、DNA双链断裂修复、核苷酸切除修复等，参与DNA损伤修复的相关基因至少130种，其变异可显著增加肿瘤发病风险，成为潜在的肿瘤标志物。染色体易位、缺失等变异也是恶性肿瘤重要的分子遗传学改变之一，其可异常激活原癌基因，并在变异后使相邻的基因融合，形成新的融合基因并表达相关产物，进而导致细胞恶性生物学行为。特异的染色体变异或变异基因产物可作为肿瘤标志物，用于肿瘤诊断、预测预后。
基于液体活检的肿瘤标志物
肿瘤标志物的检测已从静态检测转变为动态监测，研究内容也逐步丰富。液体活检通过简单的血液采样即可分析肿瘤相关标志物，并重复、动态监测肿瘤演变过程。
1）循环肿瘤DNA（ctDNA）
分析ctDNA突变有助于了解肿瘤相关遗传改变和反映肿瘤负荷，其检测可进行多基因分析，显示出较组织学检测更为快速、便捷、动态的特点。此外，对ctDNA甲基化异常模式分析也可成为早期诊断并预测肿瘤发生发展的重要标志物。2）循环肿瘤细胞（CTCs）CTCs检测可获取基于单细胞基因组、转录组学和/或蛋白质组学分析的定性信息，也可通过细胞计数为临床提供肿瘤定量信息。CTCs可在血液中成簇聚集并发生低甲基化，进而调控肿瘤转移潜能，利用药物可将CTCs 细胞簇解离成单细胞而阻止肿瘤转移。
3）细胞外囊泡（EVs）EVs是细胞分泌的携带各种核酸和蛋白质的一种脂质囊泡，可通过其获取肿瘤相关信息。EVs中多种DNA不仅可在靶细胞中发挥一定作用，还能反映肿瘤突变状况。
检测分析肿瘤细胞分泌的富含PD-L1的外泌体有助于深入探究肿瘤免疫逃逸机制，并研发靶向解除免疫抑制的治疗方法；EVs中微小RNA （miRNA）和长链非编码RNA在促进肿瘤转移、生长及耐药等方面具有重要功能，也具有作为肿瘤诊断标志物的潜力。
基于表观遗传学和代谢组学的肿瘤标志物
表观遗传学改变被认为是肿瘤发生和发展的另一重要促成因素，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、去乙酰化和甲基化及miRNA改变等。
甲基化检测在临床实践可辅助诊断肿瘤，是良好的肿瘤诊断和治疗标志物。最新研究开发了一种全基因组DNA甲基化和基因组变异的导向定位测序方法，揭示了异常DNA甲基化与早期肿瘤发生和转移的相关机制；联合检测多个基因甲基化标志物有助于提高肺癌诊断敏感性和特异性。此外，组蛋白尾部赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化代表了控制基因表达的大量表观遗传调控机制中的一个至关重要的机制。针对代谢组学在肿瘤中的研究，可使小分子代谢物成为有吸引力的肿瘤标志物，为肿瘤早期诊断及筛查提供有力手段。
其他新型肿瘤标志物
此外，还有探索了其他新型肿瘤标志物。CTC-中性粒细胞结合细胞可作为一种新型肿瘤标志物，其内与细胞周期和DNA复制通路正向调节相关的多个基因显著上调，对预测患者生存结局有一定价值；肠道微生物可通过炎性刺激、调控免疫细胞募集与活化等多种机制影响恶性肿瘤的发生发展，是近年来肿瘤标志物研究的拓展领域。
肿瘤标志物检测技术飞速发展
液体活检技术
1）ctDNA检测技术
ctDNA检测手段中，突变阻滞扩增系统（ARMS）是唯一被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床检测的一种经济快速的方法，但其敏感性仅约50%。微滴式数字PCR（ddPCR）和第二代测序技术（NGS）在检测准确性上显著提高，但操作过程复杂且价格昂贵，在临床实践中并未广泛应用。
最近，SuperARMS法作为一种改良ARMS技术，已被中国国家药品监督管理局批准用于检测晚期NSCLC中EGFR 突变状态，在保留其原有技术优势的同时进一步提高了检测灵敏度，筛选适合靶向药物的患者。
2）CTCs检测技术临床实践中富集和检测CTCs的技术方法主要有2大类：利用CTCs物理特性将其与血细胞分离的方法；在蛋白质分子水平上利用CTCs表面特有分子而开发（如基于抗原抗体反应）。目前唯一经美国FDA 批准广泛应用于临床的CTCs 检测技术是细胞搜索系统（cell search system）。高通量基因测序技术
近几年，基因测序技术已逐步进入高通量测序阶段。全基因组测序（WGS）的测序结果水平较高，提供信息较为全面；全外显子组测序（WES）仅对编码DNA进行测序，能够以更快速、经济的方式确保100倍覆盖范围，为发现体细胞突变提供了有效方法。目前，多种肿瘤基因组合（gene panel）已应用于临床实践。基因甲基化的检测技术有450 K甲基化芯片、全基因组甲基化测序等。cEMeDin-seq技术是游离甲基化DNA免疫沉淀的高通量测序技术，可在不使用亚硫酸盐处理情形下对血浆游离DNA进行全基因组甲基化分析，从而在肿瘤最早阶段检测并对其分类。第三代单分子测序技术无需PCR扩增，弥补了第二代测序技术读长较短的劣势，可避免产生测序偏差，并在测序时间和成本上表现更佳。
RNA 测序（RNA-seq）是NGS的一种相对较新的应用，可量化基因表达，检测基因融合、插入缺失，以及新转录物，分析小型非编码RNA等。
单细胞精准检测技术
单细胞测序技术针对单个细胞基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析，可准确分析肿瘤克隆演化。一项研究通过单细胞转录组学分析技术鉴定了肿瘤相关巨噬细胞亚群，首次绘制了肝癌中单个免疫细胞的动态图谱，解析了肿瘤免疫微环境。
Slide-seq技术是一种可在组织切片上进行单细胞精度转录组测序的技术，以单细胞水平的分辨率获得空间解析的基因表达数据，并绘制细胞三维组织图谱，揭示组织细胞类型。
其他新型技术
近期发现一种可用于实时监测蛋白质相互作用的新型单分子纳米传感器，可确定每一种蛋白质特性、类别及白蛋白间相互作用，在蛋白质相互作用分析及肿瘤早期诊断生物标志物筛选等方面有望发挥重要作用。
多色荧光共振能量转移（mFRET）技术是一种可检测血液样本中成百上千种蛋白质的新技术，可产生多达500种颜色微珠，对样本中多种标志物进行检测。基于人工智能、大数据库平台建设的肿瘤数据库的建立不仅是国家信息大数据采集的来源，还可推动肿瘤规范化诊治水平的建立，实现对病理学方面同质化、标准化诊断的提升。
从单一肿瘤标志物检测
到多种肿瘤标志物的联合检测
多种肿瘤标志物的联合检测可有效实现检测作用互补并提高肿瘤检出率，在肿瘤早期筛查和辅助诊断中有重要意义。
新型exoNA法是将外泌体中RNA（exoRNA）与ctDNA检测相联合而开发的；将CTCs 聚类与表观遗传学检测DNA甲基化的特定变化联系起来，并利用药物将CTCs细胞簇解离成单细胞而阻止肿瘤转移的观点也是多维度标志物联合检测的实例。IMpower 150研究显示，肿瘤及淋巴细胞的效应T细胞基因表达谱是有效的疗效预测标志物；探索基因表达谱、拷贝数变异、Lauren分类、EB病毒/TP53状态和综合基因组分析预测免疫治疗疗效的研究（NCT02589496）；研究基于10基因标记开发了结合多个免疫变量的干扰素-γ评分，然后在62例黑色素瘤患者验证集中扩展至28个基因标记，并证实两种基因评分均与最佳总缓解率和无进展生存期显著相关。肿瘤标志物检测与肿瘤
诊治临床实践相结合
肿瘤标志物检测有助于
肿瘤早期筛查和诊断
临床上对早期肿瘤、原位癌或癌前病变进行检测DNA甲基化，可为早期诊断提供重要帮助。联合肿瘤标志物和组织特异性甲基化模式可有效检测并定位肿瘤，提高肺癌检测灵敏度和特异性；多个基因甲基化标志物的联合检测可使肺癌诊断敏感性和特异性提高分别达70%和90%以上。
此外，联合检测ctDNA突变谱和常见血液肿瘤生物标志物的CancerSEEK方法，可用于筛查常见肿瘤。
肿瘤标志物检测指导肿瘤治疗并预测疗效
基于肿瘤标志物的表达水平可指导肿瘤治疗并预测治疗疗效。例如，ICIs被批准用作PD-L1+、MSI-High/错配修复缺陷难治性转移性胃食管癌的三线治疗，并进入疗效评估的临床实践。
动态监测ctDNA变化可预测肿瘤治疗疗效，并准确区分免疫治疗假性进展与真正进展。此外，基于液体活检的单细胞代谢表型分析也可预测肺癌靶向治疗或化疗疗效。
肿瘤标志物检测预测
肿瘤患者复发转移和预后
III期非转移性CRC患者术后随访期间使用Safe-SeqS技术连续监测ctDNA水平，可在常规影像学检测之前发现疾病复发。外泌体液体活检术已获FDA突破性医疗器械认定用于检测前列腺癌，并评估其预后信息。
挑战
目前肿瘤标志物的研究仍存在诸多挑战：
（1）肿瘤标志物作为反映肿瘤信息和特点的标志，检测灵敏度和准确度有待优化。（2）肿瘤标志物检测技术及平台有待优化，如不同NGS检测平台间结果不一致；单细胞测序技术的成本较高、且对检测细胞和实验室等级要求较高；ctDNA分析缺乏标准化方案。（3）基于肿瘤大数据的发展，通过大样本数据积累，借助AI技术、云计算的发展，有望加快肿瘤标志物研究进程。（4）肿瘤标志物的研发应以应用于肿瘤临床实践，帮助临床医生早期诊断、指导治疗、评估疗效与预后为目标，以制定个体化精准诊疗方案，提高肿瘤诊治医疗质量和患者生存质量，充分实现精准医学时代的要求。本文作者：白日兰，梁婷婷，崔久嵬
作者简介：白日兰，吉林大学第一医院肿瘤中心，硕士研究生，研究方向为肿瘤综合治疗；崔久嵬（通信作者），吉林大学第一医院肿瘤中心教授，研究方向为肿瘤综合诊治的基础和临床。
论文全文发表于《科技导报》2021年第7期，原标题《肿瘤标志物研究进展》，本文有删减，欢迎订阅查看。内容为【科技导报】公众号原创，欢迎转载
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