口服即能控制血糖，应用后或将提升糖尿病患者的生活质量
近日，北京大学刘涛教授课题组和华东师范大学叶海峰教授课题组在国际顶级期刊Nature Chemical Biology刊登了题为Genetic code expanded cell-based therapy for treating diabetes inmice的论文。
该工作利用基因密码子扩展（GCE）技术结合细胞治疗，开发了非经典氨基酸调控的细胞治疗系统（Noncanonical Amino acids-triggered Therapeutic Switch，NATS），实现了非经典氨基酸（ncAA）响应的胰岛素快速表达，并通过调控胰岛素的分泌来控制血糖，最终在糖尿病小鼠模型中展示出了口服ncAA后90分钟内降血糖的效果。
NAST系统在翻译水平快速调控蛋白表达
该研究的第一作者之一，黄雨佳对此工作进行了深入解读。
胰岛素等蛋白类药物面临的挑战
糖尿病是一种因胰腺产生不了足够的胰岛素或者人体无法有效地利用所产生的胰岛素时而产生的全身性的代谢异常疾病，随时间推移，糖尿病可能损害患者的心脏、血管、眼睛、肾脏和神经。
据估计，2021年全球成年糖尿病患者人数达到5.37亿，预计至2040年，这一数字将达到6亿以上。仅在2019年一年内，糖尿病直接导致了150万人死亡。
为了控制血糖，一型糖尿病患者需要注射胰岛素，而二型糖尿病患者虽可采用口服药物治疗但也可能需要胰岛素治疗。
由于胰岛素是一类蛋白类药物，因此只能通过皮下注射方式给药。而对于糖尿病这种慢性疾病的患者而言，长年累月的每日多次注射胰岛素已成为他们生活的一部分，给他们带来了极大的不便和痛苦。
除了给药方式造成的不便之外，胰岛素和其它蛋白类药物一样也面临着其它诸多挑战，如稳定性差、生物半衰期短、缓释控释的技术难题等，通过合成生物学方法改造工程细胞来生产治疗性蛋白质是目前解决这一类问题的替代方法。
相比于传统蛋白类药物，细胞疗法的优势在于直接利用埋植在机体内的工程细胞分泌胰岛素，因而避免了频繁注射给患者造成的困扰。而给这些工程细胞装配的相应调控开关，又使得胰岛素的分泌安全、可控。
然而，目前用于工程细胞的治疗性蛋白调控开关大多基于转录水平，由各种外源信号（如光、温度、化学小分子等）的刺激经各种信号通路最终作用于治疗性蛋白的转录启动，开启蛋白表达。
从转录到蛋白翻译再到蛋白分泌和真正作用于靶细胞，中间还有相当复杂的细胞内生物学过程，因而起效慢。
而对于糖尿病这一类需要即时调控血糖的疾病而言，如何让工程细胞即时响应外源信号且快速生产胰岛素是解决这一问题最大的难点。
GCE技术的生物医学应用
GCE技术是一种目前常用于蛋白质定点修饰的新兴技术。
在翻译过程中，对应于不同密码子的tRNA携带着相应的氨基酸，通过核糖体将一个个氨基酸连接而成形成肽链。当遇到终止密码子时，因为没有相应的氨酰-tRNA，翻译过程也就终止了。
这些tRNA携带相应氨基酸的过程，是由相应氨酰-tRNA合成酶（aaRS）完成的。
GCE技术通过在目的基因内部引入终止密码子，并在细胞内外源引入对应于该终止密码子的特殊tRNA、能识别该tRNA且特定识别20种经典氨基酸以外的某种ncAA的aaRS。
这一套外源引入的体系与细胞内源的翻译体系生物正交，也即不会干扰到细胞内原有的生理活动、信号通路和代谢途径。正是因为这一生物正交特性，使得目的蛋白的表达变得严格受控。
在这个体系中，外源引入的aaRS和tRNA是调控元件，ncAA是该系统响应的化学小分子信号，在没有ncAA的情况下，蛋白质的翻译提前终止，生成无功能的截短肽链产物，而只有在ncAA存在时，才能翻译出完整的目的蛋白，这样就构成了一套ncAA响应的翻译水平调控的基因开关。
GCE技术目前已用于各种翻译水平调节的生物医学应用，如生物屏障防护、减毒活病毒疫苗制备、生物节律调控等等。
与转录水平调控系统不同的是，GCE技术作用于翻译水平，因相应基因的mRNA已经存在，因此一旦提供ncAA，GCE系统即可开启蛋白翻译，因而响应速度会远快于转录水平的调控体系。
而因为这一技术本身生物正交的特性，其背景信号的干扰也相对较低。
另外，作为外源刺激信号的ncAA结构类似于人体内的经典氨基酸，无论是生物利用度或是安全性都有相当保障。
口服90分钟后即可降血糖
在这项工作中，研究人员首先以携带有异位终止密码子的分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）作为目的基因，建立了NATS报告系统，对该体系的各项特性进行了表征。
以SEAP作为目的基因的NATS报告系统
细胞实验表明，该GCE体系具有良好的作为基因开关的特性，如浓度依赖和可逆调控。
该体系除对ncAA的浓度响应非常灵敏，仅需nM级别ncAA即可启动蛋白表达外，在ncAA作为外源信号的刺激时间上也非常敏感，细胞只需接触1分钟ncAA即可满足其生产目的蛋白的需求，而这一点是其它常用转录水平调控元件所无法实现的。
NATS系统在细胞水平的分泌蛋白调控
而为了表征该体系在动物体内的各项特性，研究人员选用了两种用于临床研究的细胞包埋方法，将瞬时转染有NATS元件的细胞包裹进选择性透过膜移植到小鼠皮下，这样既不影响该体系需要的ncAA接触细胞，不干扰工程细胞合成的目的蛋白释放进入小鼠体内，但又可避免小鼠对工程细胞的免疫排斥。
动物实验结果表明，和细胞实验一样，NATS系统同样在动物体内表现了良好的浓度依赖特性，且服用ncAA后90分钟内即可在动物血液中检测到目的蛋白表达。
NATS系统在动物水平的分泌蛋白调控
在糖尿病小鼠体内，以胰岛素作为目的基因的NATS体系同样表现出了优异的ncAA响应的降血糖效果，口服ncAA后90分钟内即可实现糖尿病模型小鼠降血糖。
NATS在糖尿病模型小鼠中调控血糖
可用于糖尿病模型小鼠的长期治疗
为了将该技术用于糖尿病模型小鼠的长期治疗，还有几个问题需要解决。
首先是灌胃作为ncAA的给药方式不适用于长期给药，其次是瞬时转染的细胞系无法在小鼠体内稳定保有相应NATS元件，另外是ncAA作为响应的外源小分子信号其本身的药代动力学特点和安全性还需进一步评估。
因此，科学家们将ncAA掺杂到小鼠饲料中，将其制作成“ncAA饼干”。实验结果表明这些非经典氨基酸饼干同样可以有效降低血糖。
对于第二个问题，研究人员把相应NATS元件稳定整合到了HEK293T细胞系中，将挑选出的最佳单克隆稳转细胞系埋植在小鼠皮下，同时给予小鼠“ncAA饼干”，最终实现了在糖尿病模型小鼠体内连续30天的稳定口服控糖。
NATS用于长期血糖调控
药代动力学实验表明，该工作中所用ncAA在小鼠体内半衰期为2小时，与经典氨基酸类似，且ncAA的吸收不受进食与否影响。
在科研人员连续一个月给予小鼠含有效剂量的“ncAA饼干”后，并未观察到小鼠体重的明显变化，且在小鼠肝功能、肾功能、血常规等多种生化指标上均未观察到与对照组的显著差异。
ncAA的药代动力学和生物安全性表征
因而，研究人员们证明了该ncAA是一种安全、有效、适用于长期动物实验的外源小分子诱导剂。
未来将开展更多样化的治疗性应用
这项工作利用GCE技术开发了ncAA调控的胰岛素分泌细胞治疗体系，实现了通过口服含ncAA的饲料，在糖尿病小鼠模型体内安全、有效的长期血糖调控，为基因密码子扩展技术用于其它细胞治疗提供了参考，为设计基于细胞疗法的治疗性蛋白调控表达提供了新的视角。
对于该技术未来的发展方向，一方面要将该技术用于更多的细胞系，有望在未来改造机体自身来源的细胞用于血糖调控；另一方面，也可以联合转录水平、mRNA水平及蛋白翻译后过程等其它层级的调控来实现蛋白表达精细调控。
目前GCE技术最广泛的应用还是实现特殊结构的ncAA在蛋白质上的定点修饰，而该工作主要利用的是ncAA作为翻译通读开关的特性，而并未利用到ncAA的结构特殊性，因此，未来可结合多样的ncAA结构，进一步拓展这些调控表达的治疗性蛋白的功能，并开展更多样化的治疗性应用。
但是，该技术在被实际广泛应用之前仍需解决一些问题。
例如，这些植入动物体内的工程细胞是否能在更长期的时间段内稳定正常工作，所使用的包埋所用生物材料是否能在机体内安全、稳定地长期存在，ncAA的更长期摄入是否还会造成其它安全性问题等，这些都还需进一步评估。
此外，还需对这些工程细胞内的NATS相关元件进行进一步免疫原性评估，以及进一步研究该技术可能造成的其它全身副作用，以确保该技术实际临床应用时的安全性。
据介绍，相关工作获得国家自然科学基金、国家重大新药创制项目、国家重点研发计划“合成生物学”重点专项、北京市自然科学基金、深圳合成生物学创新研究院科研基金、上海市科委合成生物学重大项目的资助。
作者简介：黄雨佳，北京大学医学部药学院化学生物学系，博士研究生，研究方向为基因密码子扩展体系的优化以及相关应用的开发。
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