BioArt解读丨复旦徐彦辉组等在人源mTOR1复合体结构上取得重要进展——附专家点评
BioArt按：近日，来自复旦大学徐彦辉课题组、清华大学王宏伟课题组和王佳伟课题组合作发表了目前分辨率最高的4.4 Å人源mTOR1复合体结构，这项工作发表在12月1日在线出版的Protein & Cell杂志。或许有读者看到今天这个文章题目可能就会感慨怎么又是结构，可能因为最近清华结构CNS文章频出，再细看下去发现今天这篇文章报道的mTOR1结构还是发表在不那么知名的国内期刊Protein & Cell杂志上，瞬间觉得是不是BioArt有点脑子进水没有好文章报道了。其实不然，mTOR1的重要性想必不用多说，有关mTOR1的结构今年1月份Science以长文的形式发表了来自瑞士苏黎世联邦理工学院(ETH Zürich)和巴塞尔大学（University of Basel）合作完成研究，首次报道了人源mTOR1复合体结构，分辨率5.9Å。事实上国内的这项研究是有种被scoop了的意味，尽管如此，徐彦辉等人报道的mTOR1复合体的分辨率提升到了4.4 Å，虽说只有1.5 Å的提高，但是做结构的人都知道这意味着什么，再者更重要的一点是徐等人的而研究揭示了早先发表的5.9 Å结构中mTOR的N端拓扑结构有误，他们并用交联实验证实了此结论。正如浙江大学叶升教授在本文的评论中提到：有关mTOR信号通路结构生物学的研究，中外科学家正在你追我赶，竞争才刚刚开始！真切的希望在下一轮竞争中，中国的科学家能走在前头。为了让读者们对这项工作有更多的理解和思考，BioArt专门邀请了三位专家进行了系统精到的点评，希望这些评论有助于大家更好的理解这项工作的重要意义。还有一点，需要补充的就是BioArt不仅仅只是关心CNS的工作，发表在其它甚至不知名的杂志上的一流成果我们也会认真的对待报道，希望国内科学的评价不仅仅只是停留在高影响因子的刊物上，同行评议才是更科学的学术评价体系！
Protein & Cell论文和Science论文截图
论文介绍：
复旦大学徐彦辉研究员课题组、清华大学王宏伟课题组、王佳伟课题组联合攻关，获得人源mTORC1复合体的冷冻电镜三维结构（4.4 Å Resolution Cryo-EM structure of human mTOR Complex 1），该工作在线发表于12月份出版的Protein & Cell杂志。该结构是目前分辨率最高的人源mTORC1复合物结构。这也是继2011年在Gene & Development杂志（下图）发表了mTORC1信号通路下游的Gtr1p–Gtr2p复合体的结构以来，徐彦辉课题组在mTORC1信号通路领域的又一个重要成果。
mTORC1 (Mechanistic target of rapamycin complex 1)是调控细胞生长的核心蛋白质复合物，它整合生长因子、细胞能量状态、压力以及氨基酸等信号来调控蛋白质翻译、细胞自噬以及代谢，进而控制细胞的生长和增值。mTORC1信号通路异常会导致肿瘤、衰老以及糖尿病等在内的诸多疾病，因此mTORC1也是重要的药物靶点。mTORC1复合体是由三个核心组分组成：mTOR, Raptor和mLST8。mTORC1复合物结构是理解mTORC1功能的关键，但长期未能得到解决。2016年，Science杂志报道了5.9埃分辨率的人源mTORC1复合物结构。
在Protein & Cell发表的这个工作中，作者通过冷冻电镜技术解析了分辨率为4.4埃的mTORC1三维结构。对复合体结构进行分析发现mTORC1的三个组分通过mTOR蛋白介导形成二聚体（分子量约1000KD），呈现二次对称的中空菱形。分析发现蛋白整体比较柔性，表现在菱形对角的距离有较大变化，也直接导致mTORC1的分辨率难以得到进一步的提高。Raptor蛋白N末端具有保守的caspase样结构域（caspase-like domain），但不具有caspase的催化活性，此结构域朝向mTOR蛋白激酶结构域内的催化口袋区域，可能起到结合底物的作用。结构分析以及生化实验表明mTORC1的抑制剂Rapamycin与FKBP12蛋白结合形成的复合体并不破坏mTORC1的完整性，而可能阻碍了底物进入mTORC1的催化口袋，进而发挥抑制mTORC1活性的作用。结合较高分辨率的数据和交联质谱分析，该论文提出与之前Science杂志报道不同的mTOR拓扑结构。该论文的研究对于深入理解mTORC1复合体的组装以及其调控机制提供了重要的结构基础。
复旦大学生物医学研究院的杨慧蓉副研究员、刘梦杰（博士生）、陈曦子（博士生），以及清华大学的王家博士是本论文的共同第一作者，通讯作者是清华大学的王佳伟教授、王宏伟教授以及复旦大学的徐彦辉研究员。该项工作得到了如下单位的大力支持：国家蛋白质设施（上海）电镜中心、质谱中心、清华大学电镜中心、复旦大学生物医学研究院。该项研究得到了国家自然基金 (U1432242, 31425008, 91419301)等项目的资助。
专家点评：
叶升（浙江大学生命科学研究院教授，国家“杰青”，浙大求是特聘教授）
雷帕霉素靶向蛋白（the mammalian target of rapamycin, or the mechanistic target of rapamycin, mTOR）复合体调控细胞对包括氨基酸，压力，氧气和生长因子等一系列的外界刺激作出相应反应：或生长、或凋亡、或调整代谢途径。
mTOR复合体有1型和2型两种：mTORC1和mTORC2。二者都包含两个核心组分：mTOR和mLST8，区别在于第三个核心组分：于mTORC1为Raptor，而于mTORC2为Rictor。Raptor是雷帕霉素靶向蛋白调节相关蛋白（regulatory-associated protein of mammalian target of rapamycin）的缩写，而Rictor是雷帕霉素靶向蛋白的雷帕霉素不敏感组分（rapamycin-insensitive companion of mTOR）的缩写。因此，一般认为，mTORC1对雷帕霉素敏感，而mTORC2对雷帕霉素不敏感。Raptor是如何引起雷帕霉素抑制mTORC1复合体的激酶活性？最直接的回答来自mTORC1的三维结构。
复旦大学徐彦辉课题组和清华大学王宏伟和王佳伟两个课题组一起解析了mTORC1核心复合物（包括mTOR、Raptor和mLST8三个核心组分）4.4 Å的结构，这个结构，与今年1月1日发表在Science杂志上的mTORC1核心复合物5.9 Å的结构相比，虽然略晚，然而分辨率更高，两个结构的比较揭示早先发表的结构中mTOR的N端拓扑结构有误，他们并用交联实验证实了此结论。两个结构都揭示了Raptor结合在mTOR的活性部位附近，Raptor蛋白的N端结构域和caspase相似，能结合特异性的底物，但失去相应的caspase催化活性，此特点使得Raptor起到结合特异性底物的作用。此外，雷帕霉素（rapamycin）和雷帕霉素结合蛋白（FKBP12）通过空间位阻效应抑制mTOR的活性。
在mTOR信号通路的研究中，中外科学家你追我赶，竞争才刚刚开始！mTOR信号通路中的许多问题期待更多的新结构出现来回答。
张凯（MRC分子生物学实验室博士）
细胞生长和增殖是一切生命活动中最基本的现象之一。mTORC1就是在这些最基本的细胞活动中扮演着关键角色的重要蛋白复合物。mTORC1是如何响应细胞活动中一系列上游信号（生长因子、各种营养物质、能量和氧化还原状态等），以及如何调控一系列下游反应（翻译、自噬、代谢等），从而导致生长或增殖？解析高分辨率mTORC1结构是回答这些问题的关键，这将有助于人们在近原子层次上理解mTORC1的功能机制。来自复旦大学的徐彦辉、清华大学的王宏伟和王佳伟三个课题组联合攻关，在这个难题上实现了突破，解析了mTORC1复合物4.4Å分辨率冷冻电镜结构，是目前为止mTORC1最高分辨率结构。
此前，瑞士的研究人员发表于Science文章中的mTORC1冷冻电镜结构分辨率为5.9Å；一般认为，在这样的分辨率下只能成功搭建α-螺旋（α-helix) 或刚性拟合各结构域，而β-折叠(β-sheet)密度图仅以连续片层呈现，无法区分片层中的每一个单独的β-链（β-strand)，loop模型的搭建则更加困难。而发表于最新一期的Protein & Cell 文章中报道的人源mTORC1冷冻电镜结构分辨率为4.4Å，显著好于前者。虽然从5.9Å到4.4Å看上去只有1.5Å的提高，但是对于具有内在柔性的蛋白质复合物而言，在这个分辨率尺度下的任何一点提高都非常重要，也是极其困难的。一般认为，4.5Å左右的分辨率是一个突破，低于此分辨率则无法搭建蛋白质主链骨架，而最新的4.4Å密度图可清析分离Raptor蛋白的Caspase-like 结构域中单独的β-链。基于这个更高分辨率的冷冻电镜结构，同时结合生物化学、交联质谱和生物信息学等手段，研究人员提出了新的mTOR拓扑结构。多种不同的方法得出的结论互相印证，这使得中国研究人员得出的结果更加可靠；而此前发表在Science上的结果，不仅冷冻电镜结构的分辨率显著偏低，而且缺乏其它来源数据的进一步支持，结论的可靠性稍弱。
聂炎（上海科技大学免疫化学研究所Roger Kornberg课题组Co-PI）
笔者于2008年至2012年间在欧洲分子生物学实验室法国分站（EMBL Grenoble）读博，师从Imre Berger博士进行新型多蛋白重组表达系统（ACEMBL、MultiBac等）的开发以及转录复合物的结构生物学研究。在此期间，由于同在EMBL Grenoble的Christiane Schaffitzel博士（Imre的夫人）与日内瓦大学（University of Geneva）的Robbie Loewith教授合作研究酿酒酵母mTORC2的结构与功能，笔者有机会定期接触到该课题的最新进展（相关成果已于2015年以Article形式发表在Molecular Cell上：Gaubitz et al., 2016），于是也便开始对mTORC这个领域有所留意，并于第一时间注意到了今年发表的两篇关于人类mTORC1精细结构解析的突破性成果（Aylett et al., 2016; Yang et al., 2016）。得益于这两篇论文的贡献，人类mTORC1结构的分辨率一下子从2010年时的26 Å（Yip et al., 2010）提升到了目前的4.4 Å。笔者以为，促成这一重大突破的关键因素主要有两点：
一是相关实验室对人类mTORC1样品的制备方法进行了重要的优化和改进，没有沿用之前直接提取内源性复合物的方法（Yip et al., 2010），而是使用了重组表达法来进行样品制备，从而大大提升了可用于后续电镜分析的蛋白样品的数量以及纯度；
二是相关科研人员使用了最新的冷冻电子显微学（cryo-EM）设备和技术，包括采用配备了直接探测电子成像装置（direct electron detection device）的高端电镜设备（FEI Titan Krios），并使用超高分辨成像模式（Super Resolution mode）和高性能计算设施（High Performance Computation Facility）来进行电镜数据的收集及分析。
下面笔者将重点围绕这两个关键因素来展开点评。
先来看在2010年发表的Yip et al., 2010这篇文章，作者尝试从稳定表达含有N端FLAG标签的内源性Raptor蛋白的HEK293T细胞株中纯化人类mTORC1，但蛋白样品的数量和纯度都不理想。由于这一限制，该文作者只能对蛋白样品做较为简单的纯化处理。尽管他们知道mTORC1容易在制备冷冻样品的过程中解离，但也没有尝试使用化学交联试剂来提高mTORC1的结构稳定性（可能是担心进一步损失本已十分有限的样品）。此外，由于样品浓度很低，他们还不得不使用覆盖有碳膜的铜网来制备冷冻样品，以期提高mTORC1单颗粒的密度，但效果同样不佳。这导致他们收集到的mTORC1单颗粒仅有不到3万个，最终只获得了分辨率为26 Å的冷冻电镜结构。
相对而言，Aylett et al., 2016和Yang et al., 2016这两篇论文的作者都使用了重组表达的方式来制备人类mTORC1。Aylett et al., 2016这篇文章的作者使用了笔者博士导师Imre研发的MultiBac系统，通过在昆虫细胞（Sf21）中进行共表达（co-expression）的方式来过量表达mTORC1；而Yang et al., 2016这篇文章的作者则使用了共转染（co-infection）的方法在293F细胞中过量表达mTORC1，两种方法都取得了不错的效果。由于蛋白样品数量充足，两篇文章的作者可以使用更多的纯化步骤来优化样品的纯度，并使用戊二醛（glutaraldehyde）对mTORC1进行化学交联处理，从而显著增加了该复合物的结构稳定性，并为后续的电镜数据收集及处理打下了扎实的基础。之后，两篇文章的作者都收集到了约50万个（Aylett et al.,中的569,086个 vs Yang et al.,中的486,584个）单颗粒用于后续的结构解析工作。从电镜数据处理的具体细节上来看，Yang et al., 2016中所使用的方法应该更加成熟。举例来说，这篇文章的作者在经过基于2D和3D分类的颗粒分选之后，只保留了约23%的单颗粒（115,039个）用于最后的三维重构，获得了分辨率为4.4 Å的冷冻电镜结构模型。相对而言，Aylett et al., 2016这篇文章的作者保留了约54%的单颗粒（309,792）用于最后的三维重构，数量约为Yang et al., 2016中的三倍，但分辨率反而只有5.9 Å。
笔者以为，分辨率从5.9 Å到4.4 Å的提升看似不大，但却是向着最终获得mTORC1原子分辨率结构的目标迈出了扎实的一步。考虑到mTORC这类蛋白生理功能的重要性及其在抑癌药物研发上的前景，后续还有许多重要的工作有待开展[例如mTORC1、mTORC2、以及包含其它非核心组分（non-core components）的mTOR复合物的精细结构解析等]。可喜的是，国内的部分实验室（复旦徐彦辉实验室、清华王宏伟实验室和王佳伟实验室）已经建立起了成熟的mTORC1样品制备以及电镜分析的方法，具备了在这一领域内与欧美相关实验室一决高下的能力。笔者十分期待能看到国内实验室在这一领域内早日取得更大的进展和突破。
最后加一点题外话。科学界真是一个很小的圈子，这在mTORC结构与功能研究的领域中又一次得到了佐证：以Aylett et al., 2016这篇文章为例，该项目由瑞士的三个课题组合作完成。三位通讯作者分别为瑞士巴塞尔大学（University of Basel）的Timm Maier教授（曾是另一通讯作者Nenad Ban的博后）、Michael Hall教授（TOR蛋白正是由他在1991年发现的）、以及瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH Zürich）的Nenad Ban教授（曾是2009年化学诺奖得主Thomas Steitz教授的博后，在2000年以并列一作身份在Science上发表了分辨率为2.4 Å的完整核糖体大亚基的晶体结构）。有趣的是，在这篇点评的开头部分提到的Gaubitz et al., 2016论文的两位通讯作者中，Christiane Schaffitzel曾是Nenad Ban的博后，而Robbie Loewith则曾是Michael Hall的博后。笔者的博士导师Imre Berger在去EMBL工作之前，也曾在ETH Zurich工作过很长时间（Timothy Richmond实验室）。
通讯作者简介：
徐彦辉1977年3月出生。1999年清华大学生物科学与技术系获学士学位。2004年清华大学生物科学与技术系获博士学位（师从饶子和院士）。2004-2007在普林斯顿大学分子生物学系做博士后（施一公院士实验室）。2008年在复旦大学生物医学研究院组建结构生物学实验室，先后任职副研究员，研究员，复旦大学附属肿瘤医院兼职教授。课题组利用生化和结构生物学方法研究表观遗传调控及转录相关蛋白质发挥功能的分子机制，并开展靶向药物开发。在表观遗传调控机制和肿瘤发生发展的分子机制方面取得了一些列重大研究成果，以通讯作者身份在Cell（2013）、Nature (2015,2015)、Mol Cell (2011，2013，2015)，Genes Dev（2010，2011），PNAS（2012）和Nat Commun（2015,2016）等国际知名学术期刊发表论文30余篇。先后获得中组部青年拔尖人才支持计划（2012），上海市青年科技英才奖（2014）， 国家杰出青年科学基金（2014）， 药明康德生命化学奖（学者奖，2015），树兰医学青年奖（2015），谈家桢生命科学创新奖（2015） ，长江学者奖励计划（2015），中国青年科技奖（2016）和等中国优秀青年科技人才奖（2016）多个人才项目和荣誉。
王宏伟，1974年生。1996年清华大学生物科学与技术系获学士学位，2001年清华大学生物科学与技术系获博士学位（师从隋森芳院士），2001-2006于美国劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部从事博士后研究，2006-2008在美国劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部做研究科学家，2009-2011在美国耶鲁大学分子生物物理与生物化学系任Tenure-Track助理教授，2010.12-至今于清华大学生命科学学院担任教授。实验室主要从事细胞骨架与生物膜系统相互作用的结构及分子机制和RNA代谢途径中的大分子复合物的结构与分子机理方面的研究，此外，冷冻电子显微学结构解析新方法的开发与应用也是感兴趣的方向。回国后以通信作者身份在Mol.Cell（2015） 、Nat. Struct. Mol. Biol（2013, 2014，2015，2016）和 J. Cell Biol（2012）等国际知名学术期刊发表论文20余篇，于2016年上半年接替施一公院士出任清华大学生命科学学院院长一职。
王佳伟博士，2001年获中国科学技术大学材料科学与工程系获学士学位；2005年于中国科学院物理研究所获博士学位；2005-2008年于美国阿岗国家实验室/国立癌症研究所蛋白质晶体学实验室/SAIC-Frederick Inc.从事博士后研究；2008-2011年 于清华大学生物科学与技术系任高级工程师；2011年受聘于清华大学生命科学学院担任助理教授。实验室利用X射线晶体学解析与重大疾病相关的膜蛋白的晶体结构，同时探索利用细聚焦光束线测定微小膜蛋白晶体结构的技术，及微小晶体衍射相位的获取和结构分析等关键科学问题。2008年以来以通讯作者身份在Nature（2010，2011），NSMB(2015，2015)等国际著名学术期刊发表多篇研究性论文。
附Protein & Cell杂志简介：
该杂志由由高等教育出版社、北京生科院和中国生物物理学会联合创办，中科院生物物理所饶子和院士担任主编，副主编包括康乐院士、高福院士、蛋白质科学国家实验室主任许瑞明研究员，2010年创刊，最新IF:3.817。
值得注意的是，mTOR1复合体结构并不是该杂志首次发表有重要影响力的研究成果，早在2015年4月18日，protein & cell就在线了时任中山大学副教授的黄军就研团队完成的全球第一例有关利用CRISPR技术修改人类胚胎基因的报道。这项实验能帮助探讨一些重大疾病在基因层面的成因，并有助于研究胚胎发育过程中基因所发挥的作用。鉴于黄军就的开创性贡献，权威学术期刊Nature杂志2015年底将他列入年度全球十大科技人物。此外，上月该杂志还刊登了由20位中外学者联名发表的有关NgAgo系统实验重复的文章引起国内外广泛关注，详见《【快讯】20位学者联名在Protein Cell发表否定NgAgo基因编辑文章丨BioArt原创》。
（致谢：感谢徐彦辉教授为本文提供的部分信息，感谢叶升教授、张凯博士和聂炎博士的精彩点评！感谢Andy撰写的作者简介！）
BioArt原创学术解读文章：
丨管坤良组Cell报道Hippo信号通路在肿瘤免疫调节中的重要作用——附同行专家点评丨Science报道北大周德敏课题组在病毒疫苗领域的重大突破——附特别点评丨清华杨茂君课题组Cell发表突破性研究成果丨肿瘤细胞中miRNA表达量为何整体降低？丨20位学者联名在Protein Cell发表否定NgAgo基因编辑文章丨北大刘颖组封面文章揭示细胞非自主性的线粒体UPR新机制丨NgAgo波澜再现—Cell Res发文否定NgAgo基因编辑功能丨雷群英、朱冰分别在Mol Cell发表文章丨陈玲玲组Mol Cell封面文章丨徐国良院士在Nature文章阐明TET家族蛋白在胚胎发育中的重要作用丨芝加哥大学何川教授《Cell》发表tRNA去甲基化重要成果丨“自噬”获诺奖为何只授予大隅良典？——梳理自噬领域重大发现历程丨MIT顶尖学者Jaenisch组Cell发布基因组DNA甲基化编辑技术丨颉伟组和同济高绍荣组在《自然》揭示早期胚胎发育的表观遗传图景
关注请加微信号：Biogossip或长按下方二维码。投稿、转载授权事宜请联系：微信号fullbellies或sinobioart@sina.com。BioArt原创文章如未经授权，谢绝媒体转载。