Nature | 复旦表观团队揭示METTL3调控小鼠胚胎干细胞异染色质形成机制

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mRNA上的m6A修饰受到了广泛的关注，其对于mRNA的命运调控涉及其生物学功能的方方面面，包括剪接、转运、降解、翻译等，m6A主要由METTL3/METTL14复合物催化，目前的研究主要集中在METTL3/METTL14对于细胞质中mRNA的调控研究。但是METTL3是否参与以及如何参与调控染色质功能的研究相对较少。内源性逆转录病毒（Endogenous retrovirus，ERVs）元件是基因组转座子元件之一，约占小鼠基因组的10%，为了阻止这些转座元件在基因组中四处移动造成遗传突变，细胞进化出了相应的表观遗传修饰抑制这些转座子的活性。小鼠胚胎干细胞主要通过H3K9me3和H4K20me3修饰抑制转座子ERV的活性，但是否还有更多的表观遗传修饰参与其中的研究相对较少。

2021年1月27日，来自复旦大学生物医学研究院的沈宏杰青年研究员和牛津大学Ludwig肿瘤研究所的Yang Shi教授合作在Nature杂志在线发表了METTL3 regulates heterochromatin in mouse embryonic stem cells的研究论文，该研究发现METTL3通过调控内源性逆转录病毒（Endogenous retrovirus）IAPEz（intracisternal A-particles，IAP）亚群上的异染色质状态，进而抑制IAPEz元件转录。

为了探究METTL3在染色质上的功能，研究者首先通过ChIP-seq技术发现METTL3在小鼠胚胎干细胞mESCs染色质的富集主要跟异染色质修饰H3K9me3和H4K20me3共定位，呈现很强的正相关性，进一步的分析发现METTL3主要结合在内源性逆转录病毒（Endogenous retrovirus）IAPEz转座子亚群上。IAPEz转座子主要通过H3K9me3和H4K20me3修饰来沉默，H3K9me3主要由甲基转移酶复合物SETDB1/TRIM28复合物催化，H4K40me3则主要由SUV420H1/2催化，并且依赖于H3K9me3。

为了探究METTL3是否参与调控其结合位点上的H3K9me3/H4K20me3，研究者首先构建了Mettl3敲除细胞以及METTL3WT和METTL3APPA酶活突变体回补细胞，并且发现Mettl3敲除以后METTL3结合位点的H3K9me3/H4K20me3水平显著降低，并且这种降低可以被METTL3 WT回补，而不能被METTL3APPA回补，提示METTL3调控异染色质依赖于m6A修饰。同时研究者发现METTL3结合位点的H3K9me3修饰在去甲基化酶Alkbh5敲除细胞里上升，进一步支持m6A修饰正向调控H3K9me3修饰的假设。同时研究者发现Mettl3敲除以后，H3K9me3/H4K20me3修饰主要在METTL3结合的IAPEz降低，而其它转座子元件上的H3K9me3/H4K20me3则基本不变，进一步提示METTL3通过结合染色质顺式调控结合位点的异染色质修饰。进一步的RNA-seq发现METTL3结合的IAPEz RNA在Mettl3敲除细胞中上升，并且这种上升可以通过METTL3WT回补，而不能通过METTL3APPA回补，并且Mettl3敲除以后的RNA上升也主要局限在METTL3结合的IAPEz转座子。

mRNA上的m6A修饰主要通过YTHDF1/2/3蛋白促进RNA降解，研究者为了探究降解途径是否也参与IAPEz RNA的转录后修饰，研究者通过RNA半衰期实验发现IAPEz RNA的半衰期在Mettl3 敲除以后并没有显著变化，而对照mRNA Nxt1的半衰期则显著上升，提示METTL3调控IAPEz RNA含量主要通过转录调控，而不是转录后调控。研究者进一步分析了公共数据库的Ythdf1/2/3 敲除细胞的RNA-seq数据，也发现IAPEz RNA的含量不会随着Ythdf1/2/3敲除而上升，进一步支持m6A修饰不是通过转录后调控来促进IAPEz的降解。

进一步，研究者发现METTL3结合IAPEz依赖于其酶活，在回补实验中，只有METTL3WT可以结合染色质，而METTL3APPA，METTL3W475A和METTL3N477A等酶活突变体都不能结合染色质。同时，研究者发现METTL3复合物成分，Mettl14，Rbm15/Rbm15B 敲除或者Wtap, Zc3h13, Virilizer 敲低以后，METTL3在染色质的结合都降低，进一步支持METTL3结合染色质依赖于其催化产物m6A的假设。

为了探究METTL3如何调控其结合位点的H3K9me3修饰，研究者发现METTL3可以和H3K9me3甲基转移酶SETDB1及co-factor TRIM28（KAP1）相互作用，Mettl3敲除以后，SETDB1和TRIM28在IAPEz上的富集也降低，提示METTL3通过招募SETDB1/TRIM28复合物来调控H3K9me3修饰，同时研究者发现METTL3与SETDB1/TRIM28的相互作用不依赖于METTL3的酶活。

基于METTL3结合IAPEz依赖于酶活，以及METTL3是一个RNA的m6A甲基转移酶，研究者推测METTL3结合位点的顺式转录本IAPEz RNA可能对于METTL3结合染色质至关重要。研究者发现一半左右的IAPEz RNA在染色质组分，同时用ChIRP-seq和分析已发表的GRID-seq数据发现IAPEz RNA可以顺式结合在IAPEz 转座子元件上。研究者通过MeRIP-seq实验发现m6A修饰主要存在于 IAPEz RNA的5’UTR，这与METTL3更结合在IAPEz元件的5’UTR一致。考虑到IAPEz RNA含量较低，而IAPEz RNA含量在Setdb1敲除细胞可以大幅度上升，研究者在Setdb1敲除细胞中通过MeRIP-seq实验发现了更多更强的m6A信号，同时研究者用SELECT实验进一步明确了可能发生m6A的位点。

通过筛选潜在的m6A识别子蛋白，研究者通过ChIP-qPCR发现YTHDC1也主要结合在IAPEz转座子元件上，并且通过ChIP-Seq发现METTL3和YTHDC1在染色质上有很好的共定位。YTHDC1在染色质上的富集水平依赖于METTL3以及METTL3的酶活，提示YTHDC1结合染色质依赖于RNA的m6A修饰。考虑到YTHDC1对于小鼠胚胎干细胞生长是必需的，研究者首先过表达了可降解的AID-YTHDC1，然后敲除内源的Ythdc1或者突变得到失去m6A结合能力的YTHDC1W429A，通过快速降解外源的AID-YTHDC1蛋白，研究者发现YTHDC1W429A突变体在染色质的富集水平也会大幅度丢失，进一步支持YTHDC1结合染色质依赖于m6A修饰的假设。

由于METTL3结合染色质依赖于其m6A催化活性，研究者推测YTHDC1反过来促进METTL3在染色质上的结合，研究者发现METTL3在染色质上的富集在Ythdc1敲除细胞或者YTHDC1W429A细胞中都显著降低，同时伴随着H3K9me3/H4K20me3修饰水平的降低和IAPEz RNA转录的上升。进一步研究者发现METTL3可以和YTHDC1相互作用，并且这种相互作用不依赖于METTL3的酶活。最后研究者发现甲基催化酶SETDB1反过来也可以促进METTL3和YTHDC1在IAPEz转座子元件的富集。

研究者在文中还讨论了YTH蛋白在裂殖酵母和哺乳细胞中调控异染色质的异同（下图）。RNA参与异染色质形成的研究主要集中在裂殖酵母中，裂殖酵母细胞缺少m6A甲基催化酶METTL3同源物，因此YTH同源蛋白Mmi1不识别m6A修饰，而通过识别RNA上的DSR序列参与异染色质形成，而哺乳细胞中YTH同源蛋白YTHDC1通过识别METTL3催化的m6A修饰参与异染色质形成。

同时，研究者还在补充材料讨论了5’UTR和3’UTR区域m6A修饰的区别，mRNA上的m6A修饰主要在3’UTR，并且通过YTHDF1/2/3蛋白促进mRNA降解。而IAPEz RNA上的m6A修饰主要在5’UTR区域，并且不促进YTHDF1/2/3参与的mRNA降解。另外m6A修饰也存在于热激蛋白HSP70的mRNA 5’UTR，但是也不参与HSP70的降解，提示5’UTR和3’UTR可能参与不同的调控作用。

总之，这项工作发现METTL3可以结合小鼠胚胎干细胞ERV中的IAPEz转座子，通过招募SETDB1/TRIM28维持IAPEz转座子上的异染色质状态。

值得一提的是，一周前来自法国巴黎居里研究所的Deborah Bourc’his和Tomasz Chelmicki团队在Nature杂志上合作发表了一篇题为m⁶A RNA methylation regulates the fate of endogenous retroviruses 的文章，该研究揭示了m⁶A通过促进ERVs转录的mRNA降解，维护基因组稳定性的机制（Nature | RNA m⁶A调控内源逆转录病毒的命运）。

复旦大学生物医学研究院徐文绮博士是论文的第一作者，复旦大学生物医学研究院的沈宏杰和牛津大学Ludwig肿瘤研究所的Yang Shi为论文的通讯作者，复旦大学生物医学研究院的博士生李佳慧和何晨曦、温菁、荣博文、王立勇、王嘉华，副研究员吴飞珍、谭理、刁建波，同济大学的马红辉，哈佛医学院的Yujiang Geno Shi参与了这项工作。

沈宏杰主要致力于表观修饰的互作以及这些修饰在疾病和早期胚胎发育中的作用，相关研究成果相继发表在Cell (2016)、Protein & Cell (2020a, 2020b)、Nature (2021)，热诚欢迎有志于科学研究的博士后，研究生，本科生加入（联系邮箱：[e-mail]）。

复旦大学生物医学研究院近期代表性成果：

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-021-03210-1