靶向“不可成药”转录因子的新思路及进展

来源：药渡

撰文：香蕉小卢   编辑：丸子

1

转录因子介绍

转录因子通过与特定DNA 结合序列结合来帮助打开或关闭基因，调控了几乎整个基因组。所有转录因子 (TF) 都包含两个通用蛋白质结构域：一个与特定 DNA序列结合的 DNA 结合域 (DBD)，一个招募共激活因子的效应域。许多转录因子还包含一个或多个调节结构域，这些结构域通常用于调节转录因子定位和功能，例如STAT3，通过其SH2结构域来实现二聚化并调控靶基因的表达。

据估计，人类基因组中至少有 1,600 个 TF，其中约 19% 与疾病表型相关。如 p53、Myc、雄激素受体 (AR)、雌激素受体 (ER) 、缺氧诱导因子 (HIF)、NF-κB等转录因子，它们参与各种促癌事件，p53 是研究最多的肿瘤抑制因子，在超过 50% 的人类癌症中发生功能获得性突变失活或变成致癌物。核受体 AR 和 ER 分别与内分泌驱动的前列腺癌和女性癌症（如乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌）的发病机制密切相关。HIF-1在大多数实体瘤中过度表达。NF-κB是经典激活巨噬细胞的关键转录因子，可介导产生大量炎症因子。

转录因子在选择性基因调控中起基础作用，因此比激酶等上游信号蛋白具有更高特异性的疾病调节能力，并且由于基因靶标受DNA 结合特异性控制，所以单个 TF 通常只调节有限的一组基因靶标，因此这种抑制剂也不容易其他药物常见的补偿性耐药机制。所以靶向异常的转录因子是一种有效治疗疾病的策略。

但由于转录因子的结构异质性，并缺乏活性位点，传统上认为其难以成药。研究表明转录因子存在高度动态的蛋白质-DNA 和蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-DNA 相互作用界面通常是凸面且带正电荷，而蛋白质-蛋白质相互作用界面通常更平坦且缺乏结合袋，小分子很难直接靶向。

2

靶向转录因子的小分子抑制剂

其中，核受体 (NRs)和bHLH-PAS家族是类特殊的 TF 家族，其具有一个 DNA 结合域 (DBD) 和一个配体结合域 (LBD)，bHLH-PAS家族是通过与其家族成员二聚化形成LBD。当与小分子配体结合时，会诱导 NRs 构象变化，调节它们与各种转录辅助调节因子（如共激活因子或辅助抑制因子）的相互作用，从而控制下游靶基因的表达，目前开发的小分子抑制剂主要靶向这两类TFs。

核受体包括雄激素AR、雌激素ER等。AR与 AR LBD 的结合导致细胞核易位并启动靶基因表达，这是前列腺癌的关键驱动因素，因此 AR 是一种重要的治疗靶点。AR拮抗剂与LBD结合会阻断AR信号通路，恩杂鲁胺、阿帕鲁胺和darolutamide是第二代AR拮抗剂，最近已被FDA批准用于治疗人类前列腺癌，与第一代相比疗效更强，副作用减少。此外，一些AR拮抗剂正在进行临床试验，如proxalutamide和EPI-7386。为避免不良副作用（如AR信号通路对肌肉和骨骼的合成发挥代谢作用），在过去的二十年中合成和开发了选择性AR调节剂（SARMs），如GTx-024，AR或 SARM 与 AR LBD 结合并诱导构象变化，从而促进募集共激活因子，并激活基因表达。

大约 75% 的乳腺癌都是 ER 阳性的， ER 信号传导是乳腺癌的关键驱动因素。选择性ER调节剂SERM（如他莫昔芬）与 LBD 结合，阻断募集共激活因子所需的构象变化，从而降低靶基因表达。

尽管AR或ER的抑制剂或选择性调节剂能降低靶基因表达，但内在和获得性抗性的出现限制其应用。以事件驱动的方式诱导靶蛋白质降解的 PROTAC 技术在克服这个问题方面显示出巨大前景，将在下文介绍。

最后，尽管 NR 由于LBD的存在最易成药，但靶向 NR所有家族成员仍然是一项非常具有挑战性的任务。例如那些被称为孤儿受体的 NR，其没有指定的内源性配体或明显的配体结合口袋。此外在某些疾病中， NR 剪接变体的出现会使传统药物失效，例如 AR-V7，为 AR 的剪接变体。传统的 NR 靶向药物都是与其 LBD 口袋结合。最近，NR 共激活因子结合抑制剂也被开发用于调节 NR 活性。

蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 在许多生理过程中发挥重要作用，并且在疾病中经常失调。因此，PPI 也被认为是潜在的治疗靶点。例如p53-MDM2抑制剂和menin-MLL抑制剂。在癌症中，TF p53（“基因组的守护者”）和泛素 E3 连接酶 MDM2 之间的 PPI 通常作为癌细胞通过泛素-蛋白酶体系统下调 p53 水平来逃避凋亡的机制。然而p53 是一种高度无序的 TF，因此开发一种与 p53 结合并使其免受蛋白酶体降解制的小分子极具挑战性。幸运的是MDM2 的 p53 结合位点是一个相对较小且定义明确的疏水口袋，因此可以设计抑制它们相互作用的小分子药物，如HDM201 和 RG7388来抑制p53的泛素化。

共激活因子menin与MLL融合蛋白的相互作用对于 MLL 融合阳性白血病是必不可少的，因此开发小分子抑制剂对治疗白血病有效，例如已经开发的MI-538 和 MI-1481，通过阻断其相互作用而抑制白血病。

但蛋白质-蛋白质界面通常是疏水性的，难以开发具有理想成药性质的小分子化合物。与酶的活性位点或受体的结合位点相比，蛋白质-蛋白质相互作用界面更加平坦稳定，难以靶向。此外，蛋白质-蛋白质界面相对没有特征，缺乏可以完全容纳小分子配体的疏水腔。因此蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂的未来发展方向应该是优先设计新的化学、生物和计算工具，并且扩大化学库以筛选有效小分子。

3

靶向转录因子的PROTAC降解剂

在细胞中，必须破坏不必要或错误折叠的蛋白质以确保细胞蛋白质稳态，这个过程受到细胞内泛素蛋白酶体机制的严格控制。通过泛素-蛋白酶体系统劫持内源性 E3 连接酶降解感兴趣的蛋白质 (POI)，开发了靶向蛋白水解的嵌合体 (PROTAC)。PROTAC 是一种异双功能分子，含有一个与 POI 结合的配体和一个 E3 泛素连接酶的共价连接配体，通过泛素-蛋白酶体系统导致蛋白质靶标的降解。

与传统 SMI 的占用驱动操作模式不同，PROTAC 以事件驱动的方式降解POI，无需分离配体来识别靶向 POI ，提供了一种新的策略来抑制以前无法成药的靶标，且具有较强的靶标选择性，并有可能克服传统 SMI 常见的耐药性。ROTACs 能消除靶蛋白的所有功能，而不仅仅是特定小分子抑制剂所靶向的活性。并且这种方法也是催化的，允许单个分子通过重复的结合和降解循环介导多个靶蛋白的破坏，可以减少给药频率。但也有一些局限性，如不良的药代动力学特征、严重依赖E3泛素连接酶和存在潜在脱靶毒性。

目前靶向AR的PROTAC研究很多。2008 年，Crews 实验室报告了第一个 PROTAC AR 降解剂，该降解剂使用 MDM2 抑制剂作为 E3 连接酶配体,比卡鲁胺作为 AR 拮抗剂。虽然化合物131仅在微摩尔浓度下降解细胞中的 AR 蛋白，但它提供了重要的概念验证。

化合物135-137用高效的AR拮抗剂和VHL配体设计PROTAC，尽管都具有出色的降解能力，但在动物体内的口服生物利用度较低，这限制了其进一步发展。ARD69 和 ARD266 表明，具有高刚性接头的 PROTAC 能提高活性。

由高效的 AR 配体和带有刚性接头的 CRBN 配体设计的 AR PROTAC 已显示出优异的 AR 降解效力、有效的细胞生长抑制活性、良好的 PK 曲线以及有效的抗肿瘤功效。目前ARV-110已进入临床二期，它由强效抑制剂，CRBN配体通过刚性连接子相连，具有非常出色的AR降解效力、在野生型和具有 AR T878A 和 H875Y 突变体的前列腺癌患者中效果明显。Avinas 还有一款口服PROTAC 药物ARV-766正在进行临床一期试验。

尽管目前已研发出大量的激动剂和拮抗剂，但报道的 AR PROTAC 仅使用少数 AR 抑制剂及其衍生物，包括比卡鲁胺、恩杂鲁胺和化合物72来自辉瑞，且只有 CRBN 配体才能提供良好的口服生物利用度。

信号转导和转录激活因子 3 (STAT3) 是 STAT 家族的成员，可响应各种细胞因子、生长因子和癌基因信号而被激活，其激活通常与预后不良有关。STAT3通过一个Tyr705位点磷酸化的单体与另一个单体的SH2结合域的结合口袋相互作用进行二聚化，随后激活靶基因。因此STAT3 SH2 结构域的抑制剂能抑制STAT3活性。但 STAT3 和其他 STAT 家族成员共享一个高度结构同源的 SH2 结构域，难以获得高度选择性的 STAT3 抑制剂。并且单体 STAT3 蛋白也具有转录活性，因此阻断 STAT3 二聚化的 STAT3 SH2 结构域抑制剂仅部分抑制 STAT3 的基因转录活性。研究人员通过优化以前的 STAT3 SH2 结构域抑制剂 CJ-887，开发了一种可渗透细胞的 高效STAT3 降解剂SD-36。

Forkhead box M1 (FOXM1)，是一种对细胞分裂至关重要的转录因子，FOXM1 转录活性增加与癌症患者的不良预后有关。对FOXM1 的 DNA 结合域进行计算机建模，确定了一种合适的抑制 FOXM1-DNA 相互作用的小分子，并设计了一种基于 CRBN 的 PROTAC，可显着降解 FOXM1 蛋白并具有抗肿瘤活性。

与经典的转录活性抑制剂相比，这些基于小分子的 PROTAC 具有改善的口服生物利用度、低毒性和卓越疗效等优点，目前这些针对转录因子的PROTACs正处于I期和II期临床试验中。

如上所述，SMI 可以靶向 AR、ER 和 STAT3 等一些转录因子，从而可以基于这些 SMI 设计开发 PROTAC。然而，大多数转录因子仍然无法成药或难以成药。转录因子以序列特异性方式识别启动子和增强子 DNA 中的顺式调节元件，但这些关键功能位点也难以设计SMI。利用转录因子具有特定 DNA 结合序列这一特点，目前几项研究已使用这些寡核苷酸序列作为配体，开发 PROTACs 用于靶向降解转录因子。

Crews开发了一种 TRAFTAC（靶向转录因子的嵌合体），它使用异双功能双链 DNA/CRISPR-RNA 嵌合体同时结合感兴趣的转录因子 (TOI) 和 dCas9-HaloTag7 融合蛋白 (dCas9-HT7，用作中间蛋白) 。CRISPR-RNA 与异位表达的 dCas9-HT7 结合，后者又在 haloPROTAC 存在下招募 VHL E3 连接酶复合物。然后嵌合体的双链 DNA 部分识别 TOI 并使 TOI 和 E3 复合物接近诱导TOI 降解。作为概念验证，他们首先选择了典型的癌基因 NF-κB 作为靶点。NF-κB-TRAFTAC 与 dCas9-HT7 融合蛋白和 NF-κB 亚基 p50 结合，在 haloPROTAC 处理后诱导 p50 显著降解。

为了开发一种更直接的方法来降解转录因子，研究人员通过点击反应将 DNA 寡核苷酸链与 E3 连接酶配体连接，以选择性降解TOI，称为 TF-PROTAC。

通过无金属铜响应的叠氮化物-炔烃环加成 (SPAAC) 反应将市售的叠氮化物修饰的 DNA 寡聚物 (N3-ODN) 与具有各种接头 (VHLL-X-BCN) 的双环辛炔 (BCN) 修饰的 VHL 配体结合。在去除多余配体 VHLL-X-BCN 的简单纯化过程后，TF-PROTAC 已准备好转染到细胞中，通过 DNA 寡核苷酸链的选择性识别并结合特定TF，使其降解。

目前开发了两个基于 VHL 的 TF-PROTAC，NF-κB-PROTAC (dNF-κB) 和 E2F-PROTAC (dE2F)，分别有效降解细胞中的内源性 p65 和 E2F1 蛋白，并在细胞中显示出优异的抗增殖活性。总的来说， TF-PROTACs 提供了一个可通用的平台来实现 TFs 的选择性降解，但因为缺少体内数据，其临床应用仍有待确定。

4

总结

尽管基于小分子的 PROTAC 在临床上已显示巨大的前景，但寻找合适的配体来选择性地靶向转录因子依然挑战重重。由于寡核苷酸 DNA 是转录因子的天然配体，基于寡核苷酸的 PROTAC 具有普遍性和灵活性，并且可以通过替换嵌合寡核苷酸的 DNA 序列来靶向其他转录因子，从而为靶向传统上不可成药的转录因子铺平道路。此外，鉴于寡核苷酸具有稳定性、组织渗透性，免疫原性和低毒性等特点，基于寡核苷酸的 PROTAC 平台为临床开发治疗性PROTAC提供广泛前景。

尽管如此，它们的临床前和临床开发也存在众多挑战，如寡核苷酸的 PROTAC 总是带有大量负电荷，并且其次优的药代动力学和相对较低的药效可能会限制其未来发展。

作为该技术的未来拓展，RNA结合蛋白可以通过RNA识别序列形成RNA-蛋白相互作用参与多种生物学过程，包括RNA转录和mRNA翻译，鉴于转录因子和 RNA 结合蛋白之间的相似性，基于寡核苷酸的 PROTAC 为此类蛋白质的靶向降解提供思路。随着技术的成熟，确定基于 DNA 和 RNA 的 PROTAC 的临床应用前景值得期待。

参考文献

1.Nat. Rev. Drug Discovery 2021, 20, 669−688.

2.Microbiol. Immunol. 2010, 349, 25−60.

3.Molecules. 2020; 25: 2448.

4.Cell 95, 927–937 (1998).

5.Nat Rev Cancer. 2015; 15: 701–11.

6.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001, 98, 8554−8559.

7.J. Med. Chem. 2022, 65, 8772−8797

8.Cancer Cell 36, 2019 498–511.

9.J. Med. Chem. 2021, 64, 17098−17114

10.Cell Chemical Biology 2021. 28, 648–661

11.J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 8902−8910

12.J. Med. Chem. 2022, 65, 10183-10194

*药渡媒体商务合作扫码添加

点击"阅读原文",随时掌握行业动态