浙大申有青教授、高建青教授和UNCLeaf Huang教授：雷公藤红素纳米乳诱导免疫原性死亡并下调PD-L1增强黑色素瘤治疗效果

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近日，浙江大学申有青教授课题组联合北卡罗莱纳大学Leaf Huang教授以及浙江大学药学院高建青教授在《Biomaterials》发表题为“Celastrol Nanoemulsion Induces Immunogenicity and Downregulates PD-L1 to Boost Abscopal Effect in Melanoma Therapy”的研究论文，北卡罗莱纳大学Leaf Huang教授、浙江大学化工学院申有青教授及药学院高建青教授为共同通讯作者，浙江大学博士后邱娜莎为论文第一作者。

基于程序性死亡受体配体-1（programmed cell death-Ligand 1，PD-L1）的免疫检查点抑制剂在治疗晚期转移性黑色素瘤方面取得了重大成功，但由于肿瘤免疫抑制微环境的限制，接近一半的患者对用PD-L1 抗体进行的免疫治疗不响应。免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death, 简称ICD）是由一些化疗药物如阿霉素（DOX）等引起的肿瘤细胞死亡，细胞在死亡的过程中释放免疫信号分子，可以激活抗原递呈树枝状细胞和T 细胞。但使用DOX治疗的同时会升高肿瘤细胞表面PD-L1 的表达，从而通过PD-1/PD-L1途径使T细胞失活。

本研究首次发现雷公藤红素能够通过引起黑色素瘤自噬而高效地诱导细胞的ICD，并且通过抑制NF-κB 通路下调肿瘤细胞表面PD-L1 的表达将难溶性雷公藤红素包载于纳米乳，能够在细胞水平降低引起ICD的最低剂量；瘤内注射后，与游离药物相比，能够显著延长局部给药的持药量和持药时间，并降低系统血清中雷公藤红素浓度，极大减轻其毒副作用；局部注射雷公藤红素纳米乳可诱导全身系统性抗肿瘤免疫反应，同时抑制注射侧肿瘤和远端非注射侧肿瘤，显著延长荷瘤动物的生存期，实现了不依赖于PD-L1 抗体的肿瘤免疫治疗。同时纳米乳剂型组分均为FDA批准的临床用药剂组分，这种治疗策略将大大降低肿瘤免疫治疗的经济成本，具有极大的临床转化价值。

Scheme 1 瘤内注射雷公藤红素纳米乳剂能够同时诱导免疫原性细胞死亡（ICD）和下调PD-L1，增强B16F10双侧肿瘤模型的抗肿瘤效果。向B16F10 双侧瘤模型中的单侧肿瘤内注射低剂量雷公藤红素纳米乳，在注射侧持续释放雷公藤红素诱导黑色素瘤细胞产生ICD，暴露CRT 及释放HMGB1 抗原,该肿瘤特异性抗原被树突状细胞吞噬，递呈至CD8+ T 细胞，增强了效应T 细胞的激活和浸润。同时，雷公藤红素纳米乳亦可通过下调肿瘤细胞表面PD-L1 的表达，增强T 细胞的免疫杀伤效果，具有系统性肿瘤长效抑制效应。

Figure 1 体内外验证雷公藤红素能够诱导多种黑色素瘤的ICD，同时降低PD-L1的表达。（A）雷公藤红素化学结构式，（B）雷公藤红素诱导黑色素瘤细胞产生自噬，（C）鼠源黑色素瘤（B16F10和BPD6）及人源黑色素瘤（M10和A375）经过雷公藤红素处理以后的CRT、HMBG1、PD-L1的激光共聚焦成像，实验结果表明能够诱导细胞免疫原性死亡ICD。（D）流式细胞术检测四种黑色素瘤细胞与雷公藤红素孵育后CRT阳性细胞率，其中米托蒽醌和阿霉素作为阳性对照。（E）酶联免疫吸附实验检测不同ICD药物和细胞孵育后释放到培养基中HMGB1的浓度。（F）用RT-PCR分析不同化疗药物和B16F10和BPD6G细胞孵育后PD-L1 的mRNA表达量（G）蛋白质电泳分析瘤内注射各种ICD诱导药物以及腹腔注射PD-L1 抗体后黑色素瘤中PD-L1 的蛋白表达水平。

Figure 2 在B16F10双侧瘤模型中瘤内注射雷公藤红素纳米乳以及与PD-L1抗体联用的抑瘤实验。（A-D）根据抑瘤方案，设置不同的治疗组，观察注射侧和非注射侧的肿瘤生长曲线，实验终点各组的肿瘤照片以及小鼠的生存曲线。（E）图C中治疗组和非治疗组肿瘤裂解液中与肿瘤进展相关标志物的蛋白质电泳。（F）流式细胞仪检测注射以及非注射侧肿瘤中PD-L1表达的阳性细胞率。（G）肿瘤免疫组织切片分析肿瘤的凋亡。

Figure 3 雷公藤红素纳米乳液的抑瘤效应依赖于CD8+和CD4+ T细胞并具有长效记忆效应。（A）CD8+和CD4+ T细胞敲除实验。（B）单侧瘤内注射雷公藤纳米乳对于肿瘤再次接种具有长效免疫监视效应。

总结

综上所述，本工作制备得到雷公藤红素纳米乳能够在体外细胞水平以及体内肿瘤水平高效诱导鼠源以及人源黑色素瘤细胞产生ICD，同时降低肿瘤细胞表面的PD-L1表达充分激活效应T细胞及NK细胞，激活脾脏和淋巴结中的树枝状细胞；而免疫抑制细胞MDSCs 和Tregs 比例有显著地下降。局部低剂量注射雷公藤红素纳米乳即可诱导全身系统性抗肿瘤免疫反应，有效抑制给药及远端非给药肿瘤生长，实现了不依赖于PD-L1 抗体的肿瘤免疫治疗策略。

原文：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0142961220308504

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