免疫治疗丨免疫检查点抑制剂生物标志物之MMR
随着肿瘤免疫治疗时代的到来，免疫检查点抑制剂的研发和审批的进步，确保了免疫检查点抑制剂已经作为肿瘤治疗的新的有效方法之一。临床研究显示，单独使用PD-1抑制剂，只有20-40%的病人会对免疫治疗产生反应，医生很难知道免疫疗法是否对某个病人有效，如何筛选出这部分有应答的患者则是临床所面临及需要解决的问题 。（经典型霍奇金淋巴瘤是一个例外，单独使用，有效率高达80%以上）
有没有生物标志物（Biomarker）能够预测对免疫检查点抑制剂的反应？开发生物标志物对于帮助患者分层以及预估患者是否对免疫阻断单独疗法有反应，是否需要组合疗法或者接受其他的治疗是必要的。
精准医学始于靶向治疗，免疫治疗从一开始就在思考能否利用靶向治疗开辟新的成功路径。就目前而言，免疫治疗已经开辟了通向精准治疗的各种路径。
目前，影响 Immune checkpoint inhibitor（免疫检查点抑制剂）的有效生物标志物包括：PD-L1，MSI，dMMR，TMB，Neoantigen等，更多反映免疫疗效的生物标志物还在不断的研究与试验中。
今天我们聊聊MMR，dMMR也是FDA批准的PD-1抑制剂主要判定指标，而且针对的是泛实体瘤，其检测方法主要为IHC法（免疫组化法）。
MMR，MisMatch Repair，错配修复，重要的DNA修复机制。错配修复（MMR）基因是生物进化过程中的保守基因，属于看家基因，能够准确地识别及修复在DNA复制或重组过程中产生的碱基错配，小范围的碱基缺失或插入，对维持基因组稳定性，遗传后代的精确性有着重要的作用。修复的过程：识别出正确的链，切除掉不正确的部分，然后通过DNA聚合酶III和DNA连接酶的作用，合成正确配对的双链DNA。（区分母链和子链，只切除子链上错误的核苷酸，而不会切除母链上本来就正常的核苷酸，具有一定的方向性）
MMR蛋白功能
dMMR（deficient MisMatch Repair，错配修复缺陷），参与MMR修复基因发生了突变，导致基因功能缺陷，MMR修复能力下降或缺失。简言之就是MMR修复机制出现了故障。dMMR 表现为高频度微卫星不稳定（MSI-H）。
其次需要理解的概念是pMMR，proficient MisMatch Repair，正常错配修复，pMMR指MMR表达正常。pMMR 表现为低频度微卫星不稳定（MSI-L）或微卫星稳定（MS-S）。
下面我们来说个故事
在上一篇我们有说过：MSI的发生的原理就如同小学生抄课本一样，小学生照着课本抄（DNA复制的过程），但是在抄的过程中也会抄错（MSI发生），可能一个字（MS）抄了很多遍，也可能好几个字（MS）抄了很多遍，这时候错误越来越多就会形成不同程度的错误（MSI-L，MSI-H）。那么MMR是什么呢？
MMR就类似于小学生的爸妈，当小学生抄课本出错的时候，爸妈是可以检查出错误的地方并进行修改（MMR），如果爸妈因为某种原因自身也出错了（离婚/吵架，dMMR），那么他就不能够检查并修改小学生的作业错误（MSI），进而导致了作业的重大错误（MSI-H的产生）。
所以，如果小学生的爸妈因为某种原因（离婚/吵架，dMMR）导致了他们没有时间来管理和教育孩子，小学生在这样的环境下，很容易写作业不用心，就会出现各种错误（MSI），这时候爸妈也没办法来进行一个检查和修改，故可以简单的认为是因为爸妈的问题（dMMR）导致了孩子作业出现了不同程度的错误（MSI），进而的影响结果就是成绩的下滑（肿瘤的发生），所以说爸妈的问题（dMMR）与孩子的成绩下滑（肿瘤的发生）是息息相关的。
这时候小学生的成绩下滑了（肿瘤发生了），老师（免疫细胞）是可以通过学生最后提交的作业情况来看出这个学生的状态，抄课本错本（MSI-H）最后导致的情况是作业得了个差评（新抗原产生），老师可以通过作业差评对这个学生进行一个接触并进行一个辅导和教育，进而改善学生的作业情况并提高学习成绩（减少肿瘤细胞，提高疗效）。（自编自导自演）
在临床医生的脑海里，一般都会默认MMR基因缺陷（dMMR）=高频微卫星不稳定性（MSI-H）。在生物过程上来讲，dMMR是因，MSI-H是果，正是由于错配修复蛋白的功能异常，导致了DNA复制过程中随机产生的错误无法被正常修复，从而出现了MSI-H的现象。值得一提的是从实际情况中，也会出现检测到了MSI-H现象却没有发现dMMR的情况，这种情况可能是由于我们检测dMMR的方法造成的假阴性，比如我们只检测了常见的4个MMR蛋白来确定dMMR，实际上错配修复通路上的其它基因异常也会造成dMMR现象；还有一个原因可能，就是MMR基因非同义突变有时会损失MMR功能，但却保留其抗原性，故能被蛋白能被抗体检测识别，出现假阳性（约5~11%的MSI发生并不会出现MMR蛋白的缺陷，某些蛋白错义突变，会损失MMR功能，但能被抗体检测识别）。
MMR基因在人类中多达12个，其中最主要的4个基因是：MLH1、PMS2、MSH2和MSH6（数据积累最多）。其中MLH1和MSH2蛋白是MMR家族中的主要成员（突变占90%以上）。
在人类中，DNA错配修复体包括特异性蛋白MutS，MutL，MutH和SSB等其他与修复功能相关的非特异性蛋白，其中MutS是第一个起作用的蛋白，是系统中的错配识别蛋白；MutL在错配修复系统中起中介和协调作用；MutH在半甲基化GATC位点切除未甲基化的新生链。
人类至少有5个mutS同系物（mutS homologue ，MSH）基因，比如MSH2, MSH3, MSH6在MMR中起作用，MSH4和MSH5，参与减数分裂重组，系统发育和系统分析，揭示了这些基因是从MSH1进化而来的。同样，已知四个mutL同系物（mutL homologue，MLH）基因：MLH1、MLH3、PMS2和PMS1 （后两个以他们的酵母同系物命名），迄今为止没有关于mutH的同源词。
大肠杆菌和人类的DNA错配修复系统的组成
在有丝分裂和减数分裂细胞中，MutS和MutL同源物至少形成6个多具体复合物。比如下图A，在有丝分裂的细胞中，这些复合物可以识别碱基错配（图中红色菱形钻石状）和插入/缺失的环状区。比如下图B，在减数分裂的细胞中，基于MSH4 - MSH5的复合物可能涉及到对复合中间体的识别，如Holliday连接。（在此指出的是，MSH4-MSH5与MLH1-PMS2或MLH1-MLH3之间的直接相互作用并无生化证明）
MSH2基因可分别与MSH6和MSH3形成复合物，即MutS-α和MutS-β，前者识别单个碱基错配及一个碱基的缺失／插入错配，后者识别2～4甚至更多个碱基的缺失／插入错配；同理，MLH1基因可分别与PMS2、PMS1和MLH3形成复合物，即MutL-α、MutL-β及新的复合物。（也有文献报道MLH1基因可分别与PMS2、PMS1和MLH3形成复合物，即MutL-β、MutL-α及新的复合物）
上图中：针对>1bp插入/确实区域举个例子：MSH2可与MSH3形成异源二聚体MutS-β，协同MutL-α（MLH1/PMS2）特异性识别并修复较大片段（>1bp）的插入和缺失。这些蛋白复合物一旦检测到碱基错配，就能与有关的酶配合，切除含有错配的DNA片段，并合成新的DNA片段以代替被切除的部分，进而完成错配DNA链的修复过程。
MMR基因工作原理图
MMR蛋白如何解读
MMR常检测四个蛋白，那么判读的时候是读阴阳性呢？还是要报百分比？
MMR检测结果的判读标准是一样的，都不用报百分比。国外文献中一直强调“任何肿瘤细胞阳性即判断为阳性”，也就是完全阴性才是阴性，才有意义；但实际工作中确实有个别病例会有极少数肿瘤细胞阳性（不足5%），这样的病例通常也是MSI-H，这时候会建议再用PCR法验证。
日常工作中更常见的是由于组织固定不佳导致的假阴性，判断的关键是注意间质内对照细胞表达情况，如果内对照的淋巴细胞、纤维细胞、血管内皮细胞也是阴性则该区域不能用来评判，应寻找内对照细胞表达阳性的区域。
免疫组化主要检测癌组织中 MLH1，PMS2，MSH2 及 MSH6 这 4 种蛋白的表达：
1. 若结果显示任一蛋白完全缺失，则判读为 dMMR；
2. 若显示无蛋白缺失，则判度为 pMMR。
正常组织中MMR蛋白应该呈阳性，当MMR基因发生突变时，MMR蛋白阴性。因此，当肿瘤细胞显示核染色阳性时，则将该病例判为MMR蛋白正常表达，否则判为表达缺失。阳性对照为正常子宫内膜和（或）淋巴细胞阳性核染色。（错配修复蛋白是一组细胞核内酶，存在于所有的增值细胞内，参与发生于DNA复制过程中碱基错配的修复）
错配修复蛋白染色结果判断应注意以下几点:
1，着色部位是否为核；
2，内对照（上皮细胞：正常肠上皮特别是腺体基底部细胞；间质细胞：淋巴细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞等）是否阳性；
3，肿瘤细胞的细胞核是否为阳性（通常任何肿瘤细胞表达即判断为该错配修复蛋白阳性）。
图1，正常子宫内膜中MMR阳性，SP法；图2，子宫内膜癌中MLH1阴性，SP法；图3，子宫内膜癌中PMS2阳性，SP法；图4，子宫内膜癌中MSH6阳性，SP法。
MMR检测的意义
一、MMR/MSI最开始主要在结直肠癌中进行研究，而且结直肠癌是一种遗传异质性的疾病。约15%的结直肠癌存在染色体组不稳定性，而染色体组不稳定，是由于不同程度的微卫星不稳定造成的，其中3%为Lynch综合征，另外12%为散发性。
此外，TNM Ⅱ期或Ⅲ期的CRC伴 dMMR（MSI-H ）的患者预后更好，但接受 5-FU 为基础的辅助化疗并不获益，而对含奥沙利铂或伊立替康的化疗有效。
二、肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤治疗中最令人兴奋的发展，尤其是PD-1/PD-L1免疫疗法已成为当今热门话题。dMMR是预测肿瘤免疫治疗的一种有效生物标志物。
2017年5月23日，FDA加速批准默沙东KEYTRUDA（pembrolizumab）治疗带有错配修复缺陷（dMMR）的实体瘤患者，成为第一个“广谱免疫药物”。2017年 8 月1 日，FDA 加速批准OPDIVO（nivolumab）用于治疗错配修复缺陷（dMMR）的12 岁以上转移性结直肠癌患者。
延伸：MMR与MSI的那些故事一种或多种错配修复蛋白表达缺失提示为MSI-H肿瘤（但是MSH6缺失不好说）。通常MLH1功能缺陷会合并PMS2表达缺失，而MSH2缺陷则常合并MSH6表达缺失，反之不然（一般情况下，MLH1和MSH2的突变会分别导致PMS2和MSH6蛋白降解，另一方面，PMS2或MSH6的突变可能不会导致其首要火爆（MLH1和MSH2）的蛋白水解降解）。以下为错配修复蛋白免疫组织化学检测结果解读参考：
*MSH2和MSH6表达缺失通常由于MSH2胚系突变。#MLH1可通过胚系突变或MLH1启动子高度甲基化而灭活。MLH1启动子甲基化通常伴有体细胞BRAF V600E突变。缩写：+，表达；-，缺失；
1，dMMR蛋白主要通过免疫组化法（IHC）检测，蛋白表达正常提示为MSI-L/MSS，只要有任何一个蛋白功能缺陷，即提示为MSI-H；但是，约5%-11%的MSI发生并不会出现MMR蛋白功能的缺陷，有文献提示两者的一致性为93.7%或更高。
2，dMMR蛋白检测主要包括MLH1，MSH2，MSH6，PMS2；其中尤其需要注意MLH1基因：MLH1蛋白功能缺陷可能是由于MLH1基因启动子区域甲基化引起MLH1基因发生表观遗传学沉默，MLH1甲基化是导致MSI-H的常见原因；此外MLH1蛋白缺失可能是由于BRAF突变所致MMR基因沉默引起的，BRAF突变可能导致MLH1功能缺陷，进而导致MSI-H发生。
3，dMMR包括MMR胚系突变和MMR蛋白缺失，MMR蛋白缺失主要是由MMR基因胚系突变引起，因此，基因检测是最准确判断dMMR的方法（NCCN指南推荐用IHC方法检测dMMR）。
4，MMR基因可以通过基因测序进行检测，但不能直接根据变异情况（非同义突变）提供基因功能异常的证据，无法直接判断MMR蛋白表达/MSI状态。
5，MMR基因非同义突变有时会损失MMR功能，但却保留其抗原性，故能被蛋白能被抗体检测识别，出现假阳性，此时需要PCR检测MSI。
6，MSI常见检测方法为多种荧光PCR法，但不能根据PCR的检测结果直接判断4种MMR蛋白中哪个蛋白功能缺陷，无法通过MSI检测判断与MSI相关的结直肠癌是Lynch综合征还是散发性结直肠癌。
7，微卫星不稳定的检测（MSI）一般是通过毛细管电泳的方式，比较容易在其他癌种当中做到标准化，但MMR的免疫组化评分，从结直肠癌跨越到其他实体瘤中，应该具有什么样的染色标准，四种蛋白之间的正常表达，缺失表达到底是什么判断标准，还需要病理医生多做工作。
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