液体活检丨新型碳纳米管CTC芯片在乳腺癌患者中检测灵敏度可达100%！

液体活检的概念一直受到肿瘤界的广泛关注，相比传统的组织活检，液体活检主要具有非侵入性，患者依从性好，异质性低，可反复取材等优势。循环肿瘤细胞（CTC，Circulating Tumor Cell），即肿瘤在生长过程中，向血液循环中释放的各类肿瘤细胞的总称，是导致肿瘤扩散的关键因素。是液体活检的三宝之一（点击查看）。
CTC从肿瘤病灶脱离后进入外周血随血液流动，沿着血流方向来寻找合适的“土壤”来生长，最后要么被毛细血管截留或者粘附在血管壁上，要么就在外周血中循环最后被清除，只有极少数目的 CTC 能附着在血管壁上，重新穿过血管，到达新的“土壤”，适应环境后成长为新的肿瘤。做CTC的公司自然能说出CTC的一大堆优势，比如实时活检，分期诊断，动态监测，预后判断，用药指导，早期检测等。其中，最重要的一个优势当属于CTC具有完整的细胞形态，甚至某些捕获方法获取的CTC还具有生物功能活性，可进行下游的蛋白质组、转录组及基因组等遗传性分析，还可以进行下游的细胞培养及动物体内实验（比如PDx）等功能性研究。目前，影响CTC领域更进一步发展的主要瓶颈在于缺乏得到广泛认可的CTC检测体系。CTC检测的最大困难在于其在外周血中含量稀少，通常每10亿血细胞中只有1-10个CTCs。¹ 在庞大复杂的正常细胞背景干扰下，比如巨核细胞、内皮细胞，未成熟的造血细胞，上皮细胞等，很难实现高灵敏、高特异的CTC 捕获检测。尽管目前市场有各种各样用于分离及检测CTC技术，但由于缺乏必要的敏感性，它们的临床应用并不被广泛采用，大多数技术往往受到捕捉性的限制，在捕获的高效率与高纯度之间难以进行权衡。

EMT（上皮间质转化）现象的存在，致使已经被 FDA/CFDA 批准用于CTC临床检测的强生 Cell Search^® 系统检测效率并不理想（2016年底，强生便出售了其旗下所有与 Cell Search^® 系统相关的资产和业务），同时，“催化了”被 CFDA 批准用于CTC临床检测的国产 CytoploRare^® 系统的诞生。两者的主要差别之一就是CTC的捕获：一个是正向富集，一个是负向富集，各有各的优劣势。

▲ Cell Search^® vs CytoploRare^®系统

捕获外周血的CTC，

犹如大海捞针一般困难，

尤其在捕获率和灵敏度方面，

是大家不断努力想实现的目标。

下面是一张CTC的捕获超清图：

▲ 图片来源：CURTIS SAYERS

图中，附着在碳纳米管表面上的粉红色细胞是循环肿瘤细胞（CTCs），不粘附在碳纳米管表面上的蓝色细胞是白细胞（WBCs），随后被冲走。该装置的核心部件是一层碳纳米管，其排列在硅/玻璃晶片中形成的小井的底部（芯片设计充分利用了CTC附着的自然趋势）。这种CTC捕获方法的捕获率达到89~100%，灵敏度达到了100%！

该结果于2019年6月7日发表于微流控领域国际顶级期刊《Lab on a Chip》（IF=6.914）。在真实的乳腺癌患者血液样本中（1-4期），这项技术检测CTC的灵敏度为100%。所有受试的7个乳腺癌患者的血液中都能捕获到CTC（4~238 CTCs/8.5ml），而2个健康对照的样本中则完全没有捕获到肿瘤细胞。² 

▲ 碳纳米管CTC芯片是极具应用前景的液体活检技术

1碳纳米管CTC检测步骤

利用碳纳米管CTC芯片对不同表型的CTCs进行分离、捕获和计数，大致可分为四个步骤：

▲ 碳纳米管CTC芯片检测步骤

① 从患者身上采集 8.5ml 血液，包括大约 400亿 个红细胞、6400万 个白细胞和 1-10 个不同表型的CTCs；

② 将红细胞（RBCs）全部裂解去除，并将CTCs与白细胞（WBCs）组成的有核细胞富集；

③ 通过碳纳米管CTC芯片进行捕获：抗原无关CTC捕获方法，可高纯度富集CTCs，不受肿瘤细胞上潜在的可变表达标记物选择的影响；

▲ 碳纳米管及芯片组成（76元件阵列组）

④ 将附着在碳纳米管表面的CTCs进行芯片上的免疫染色，利用抗体等识别不同表型的CTCs。CTCs采用DAPI，CK8/18及其他抗体（HER2/EGFR）进行鉴定，WBCs采用CD45和DAPI进行鉴定。

▲ CTCs与WBCs的鉴定：CTCs通常不大于WBCs，图中说明了这一点。所有标尺都是一样的。

▲ CTCs与WBCs：HER2及EGFR抗体进一步鉴定

2研究结果情况

研究者利用标记有荧光染料的已知数量肿瘤细胞的血液对这种新型芯片进行验证，其灵敏性极高，受试样本中89%至100%的肿瘤细胞都能被成功捕获。

此外，研究者还在乳腺癌患者（1-4期）血液中对此项技术进行了验证，这项技术检测CTC的灵敏度为100%。所有受试的7个乳腺癌患者的血液中都能捕获到CTC（4~238 CTCs/8.5ml），而2个健康对照的样本中则完全没有捕获到肿瘤细胞。

▲ 从CTC添加模型和病人血液中捕获的CTCs数量

血液与碳纳米管保持接触的时间越长，芯片的灵敏度越高。从这些实验中，研究者得出结论，48小时是获得最高捕获效率的最佳时间，而附着在碳纳米管上的白细胞数量可以忽略不计。

▲ 48小时是获得最高捕获效率的最佳时间

同时，研究者还比较了几种已报道的CTC技术与碳纳米管CTC芯片的性能，证实碳纳米管CTC芯片方法不仅能够高效的识别CTCs，还能够将捕获的CTCs用于进一步的培养。

▲ 已报道的CTC技术与碳纳米管CTC芯片的性能对比

目前，研究人员已经准备好将这项技术应用于人体的临床试验，用于癌症的早期检测。结果值得期待！

其实，

不管 CTC 检测技术的具体形式如何，

最为关键的是 必须要以解决临床问题为根本出发点 。

国内液体活检产业正在如火如荼的蓬勃发展，各种技术都在日新月异的变化，无疑会带来更多市场格局的变化，从研究到临床转化研究再到临床应用，是一个漫长而严谨的道路，希望CTC技术能够早日成熟，造福于更多的肿瘤患者！

▼ 基于微流控芯片技术的CTC检测新方法

参考资料：

1.Mocellin Simone,Keilholz Ulrich,Rossi Carlo Riccardo et al. Circulating tumor cells: the 'leukemic phase' of solid cancers.[J] .Trends Mol Med, 2006, 12: 130-9.

2.Loeian Masoud S,Mehdi Aghaei Sadegh,Farhadi Farzaneh et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients.[J] .Lab Chip, 2019, 19: 1899-1915.

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