【Science】明察秋毫！新型电压指示剂带你探索更深层次神经元活动

衣食住行，这些日常行为指令均由神经元所编码。若想了解神经元如何介导或调控不同功能，我们需高速、长时间记录这些神经元的活性。大量研究通过遗传编码的钙信号指示剂（Genetically encoded calcium indicators, GECIs）记录神经元活性，但是钙信号衰减较慢，并不能充分表征神经元的动作电位，而且阈值以下的电压信号完全被忽略[1-3]。 

基于钙信号指示剂的钙成像结果

图片来源：SlideServe

为克服这些缺陷，近期研究开发了遗传编码的电压指示剂（Genetically encoded voltage indicators, GEVIs），通过GEVIs我们可以成像神经元的快速放电信号与阈下电活动[4, 5]。但是，现存的GEVIs依赖于微生物视紫红质[6]或荧光蛋白[7]，这些荧光基团缺乏亮度与光稳定性，在很多实验中难以胜任。

三种类型GEVIs的示意图

图片来源：Trends in neurosciences [8] 

2019年8月16日，《Science》杂志在线刊登了霍华德·休斯医学研究所Eric R. Schreiter研究组的最新重要工作[9]，他们开发了一种电压指示剂合成染料——Voltron，将成像神经元的数量扩大10倍，且成像时间更加持久。Voltron在小鼠、斑马鱼和果蝇中均可实现电压成像功能。该研究弥补了传统GEVIs的部分局限与不足，极大提高了神经元电压成像的实用性。

 Eric R. Schreiter, PhD

图片来源：Howard Hughes Medical Institute

结果

1.新型电压指示剂Voltron的开发

首先，我们介绍一下Voltron的结构。Voltron结合了电压敏感性微生物视紫红质结构域和染料结合蛋白结构域，后者不可逆地结合一种人工荧光染料配体（图1A-B）。然后，作者在培养的大鼠神经元中探究Voltron的电压成像效果。他们发现结合不同类型染料配体的Voltron均可表征神经元的动作电位和阈下电活动，其中结合JF₅₂₅、JF₅₄₉的Voltron （Voltron₅₂₅、Voltron₅₄₉）电压敏感度最佳（图1C-E）。而且，Voltron₅₂₅、Voltron₅₄₉的信号强度与光稳定性均远高于传统GEVIs Ace2N-mNeon[10]和ASAP2f[7]（图1F-I）。在体条件下，Voltron可胜任斑马鱼小脑神经元与果蝇多巴胺能神经元的电压活性记录（图1J-K）。

那么，在更高级动物中，Voltron的电压成像效果如何呢？

 图1 新型电压指示剂Voltron的开发

2.在体条件下Voltron的功能性验证

为在小鼠大脑中检验Voltron的成像效果，作者在PV-Cre小鼠的海马CA1亚区中注射AAV-Flex-Voltron₅₂₅，发现CA1中快速放电的小清蛋白阳性（PV⁺）神经元的动作电位可清晰成像（图2A-G）。他们又在小鼠初级视觉皮层中混合注射AAV-Cre和AAV-Flex-Voltron₅₂₅，给予小鼠黑白条纹视觉刺激，发现不同方向运动的条纹引起的电压活动不同（图2H-L）。

图2 通过Voltron成像海马、皮层神经元电压活动

接下来，作者在小鼠皮层中更长时间地成像更大面积、更多神经元。他们在NDNF-Cre小鼠初级视皮层中注射AAV-Flex-Voltron₅₂₅，并连续成像15分钟。发现扩大成像面积后，皮层神经元动作电位的成像清晰可见，相邻神经元之间的电压信号易于分辨（图3）。他们共成像12个视野，总计449个神经元。

图3 通过Voltron长时间大面积成像皮层神经元电压活性

3.Voltron电压成像揭示毫秒级神经活动

最后，作者通过视觉刺激诱发幼年斑马鱼运动，同时使用Voltron成像幼鱼的中脑神经元电压活动（图4A）。他们发现不同神经元表现出不同的电压活动模式，有些神经元在幼鱼运动前1秒发放（图4B-C）；有些神经元在幼鱼运动时被抑制（图4D）；还有些神经元在幼鱼每次运动时发放（图4D）。这三种神经元即包含编码运动起始的神经元也包括受运动影响的神经元，它们空间分布上混合在一起（图4E-G）。因此，使用基于Voltron的电压成像方法可以区分编码运动的神经元以及感觉-运动整合神经元，而单细胞电生理记录和钙成像无法实现。

图4 Voltron电压成像揭示毫秒级神经活动

总结

神经元功能成像是探究神经元编码各种功能的重要科学手段，目前最常用方法为钙成像和电压成像。然而，神经元钙信号衰减很慢，不能充分表征动作电位与阈下电位；依赖于微生物视紫红质或荧光蛋白的电压指示剂缺乏亮度与光稳定性，在很多实验中难以胜任。本篇文章开发新型GEVI——Voltron，此类基于荧光染料的电压指示剂可以胜任离体培养神经元与多种生物神经元的功能学成像，记录时间显著延长，同时记录的神经元扩大10倍。这项研究克服了传统GEVIs的很多局限性，为科学研究中神经元的功能成像提供有力支持！

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参考文献：

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