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药物载体|外泌体递送shRNA小环可治疗帕金森病

Summer 和元生物 2022-04-16

帕金森病(PD)是世界上第二大常见的神经退行性疾病,但目前仍缺乏有效的疾病治疗方法。在家族性帕金森病中,α-突触核蛋白基因(SNCA)发生了大量突变和倍增,且全基因组关联研究(GWAS)已经发现SNCA位点是潜在的PD危险因素。在所有PD病人的路易斯小体中,我们观察到α-突触核蛋白聚集比较明显,因此α-突触核蛋白在PD发病中起着重要的作用。

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PD治疗可以借助基因疗法实现,即使用一个精准有效的传递系统将干扰α-突触核蛋白基因的分子(siRNA或shRNA)递送到中枢神经系统(CNS),且能较长时间内降低基因表达以治疗疾病。本文作者将狂犬病毒糖蛋白(RVG)肽修饰在外泌体(Exosomes)表面,形成RVG-exosomes,作为特定靶向大脑的分子载体,同时作者选了一种小环状的shRNA(shRNA-MC)用于干扰α-突触核蛋白基因。结果表明,将装载了shRNA-MC的RVG-exosomes注射入大脑后可以诱导脑内蛋白表达的长期下调,故可以作为一种有效的PD治疗手段。此种方法也可以用于其他神经退行性疾病的治疗。

Graphical Abstract


实验结果:

1.  RVG-exosomes装载shRNA-MCs的条件优化与验证

从转染了RVG-Lamp2b的原代树突状细胞的条件培养基中分离出RVG-exosomes,再优化shRNA-MCs和RVG-exosomes的装载条件。作者将1ug anti-GFP shRNA-MCs装载入3ug RVG-exosomes,装载效率用SH-SY5Y细胞中GFP表达下调情况来评估。实验结果表明使用电穿孔方法且条件为450V-100mF时GFP被敲低的效果较为明显。随后检测了电转后外泌体的大小仍属正常范围内,及用DNase 保护检测实验证明了shRNA-MCs的确存在于外泌体内(图1A)。

在GFP表达的SH-SY5Y细胞中,作者通过不同的递送方式研究anti-GFP shRNA-MCs对GFP表达下调的效果,并与肌动蛋白水平进行比较(图1B)。实验结果显示,与对照组相比,细胞用X-tremeGENE HP转染试剂转染了1ug GFP shRNA-MCs后,GFP蛋白下调了47%;细胞用纯化的电转了1ug anti-GFP shRNA-MCs 的RVG-exosomes处理,发现GFP蛋白下降了45%,这与细胞用装载了GFP shRNA-MCs的RVG-exosomes后再用DNA酶处理了未封装DNA的效果相似。

为了研究CNS中shRNA-MC RVG-exosomes下调基因表达的能力,作者分别将150ug RVG-exosomes电转了不同浓度的anti-GFP shRNA-MC(100ug或150ug MCs)静脉注射入过表达GFP的转基因小鼠。30天之后,GFP蛋白水平在嗅球和中脑区域明显降低,而在装载了150ug MC的外泌体处理组,其GFP蛋白下降总是更高。从电转化的RVG exosomes (150ug shRNA-MCs和150ug RVG-exosomes)中提取anti-GFP shRNA- MC构建体,发现RVG-exosomes中shRNA-MC DNA的回收率为19%±5% (30ug shRNA-MCs/150ug exosomes)。

作者的研究结果说明,anti-GFP shRNA-MCs可以成功装载到RVG-exosomes中,在静脉注射后至少30天在选定的大脑区域中能下调GFP蛋白水平。

2.  用shRNA-MC RVG-exosomes实现α-突触核蛋白的下调
基于以前的siRNA下调研究,作者构建了一个靶向小鼠和人类α-突触核蛋白mRNA的anti-GFP shRNA-MCs序列结构。用之前优化好的装载条件将1ug anti-α-突触核蛋白shRNA-MC构建物装载入3ug RVG-exosomes中,并在过表达S129D α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞中检测他们下调α-突触核蛋白的能力。与对照组相比,作者分别脂质转染了anti-α-突触核蛋白shRNA-MCs (MC-TR)、shRNA-α-突触核蛋白原质粒(Plasmid-TR )、anti-α-突触核蛋白siRNA(siRNA-TR)72h后,S129D α-突触核蛋白水平显著降低。实验结果表明,通过RVG-exosomes传递shRNA-MCs到SH-SY5Y细胞的效率至少与转染相同(图1C)。

作者用在朊病毒启动子下表达了磷酸化人S129D α-突触核蛋白-HA的转基因小鼠模型来研究含有anti-α-突触核蛋白shRNA-MCs的RVG-exosomes在体内下调α-突触核蛋白的递送效率。该模型从3个月大开始就在整个大脑中展现出α-突触核蛋白的聚集体。

作者分别将电转了anti-α-突触核蛋白shRNA-MCs(150ug)和anti-GFP shRNA-MCs(150ug,对照组)的RVG-exosomes (150ug)采用静脉注射注入10-14周大的转基因小鼠中,注射后45天处死小鼠并检测α-突触核蛋白mRNA和蛋白水平。实验结果显示,注射了载有anti-α-突触核蛋白shRNA-MCs的RVG-exosomes实验组表现出所有研究区域中S129D α-突触核蛋白-HA mRNA水平下调,其中在中脑区、皮层、纹状体和脑干显著降低,但是注射了载有anti-GFP shRNA-MC的RVG-exosomes处理组中没有一致的变化趋势(图1D)。在α-突触核蛋白shRNA-MCs实验组中,在所有研究的区域中S129D α-突触核蛋白-HA蛋白水平均低于对照组,其中在嗅球和中脑区下降较为显著(图1E),因此数据显示在CNS这种治疗可以实现长期下调α-突触核蛋白的潜能。

3.  用载有α-突触核蛋白shRNA-MCs的RVG-Exosomal处理可预防PD的Syn PFF小鼠模型中的神经退化

虽然体内用RVG-exosome递送anti-α-突触核蛋白shRNA-MCs能在较长时间内降低大脑α-突触核蛋白的表达水平,但重要的是要确定这种处理是否会影响帕金森病的临床、病理和退行性变化。作者向小鼠纹状体中注射α-突触核蛋白原纤维(Syn PFFs)构建了进行性α-突触核蛋白病小鼠模型,该小鼠模型表现出α-突触核蛋白聚集的逐步扩散,多巴胺能神经元的丧失以及影响运动功能的临床缺陷,故此模型是评估该疗法对PD相关的关键临床和病理特征疗效的理想选择。
初步研究旨在建立Syn PFF模型,并确认该模型中RVG-exosome递送anti-α-突触核蛋白shRNA-MCs治疗的有效性。作者向24只正常C57BL6/C3H小鼠的单侧纹状体内注射了小鼠α-突触核蛋白PFFs。两天之后,再将分别装载了α-突触核蛋白shRNA-MCs(150ug)和anti-GFP shRNA-MCs(150ug)的RVG-exosomes(150ug)进行静脉注射,同时也设置了空白对照。小鼠在注射30天后进行处死处理。
30天后,在注射了Syn PFF的小鼠模型中,与对照组小鼠相比,同侧(图2A)或对侧(图2C) 大脑区域的α-突触核蛋白mRNA水平没有发生明显变化。纹状体中α-突触核蛋白的蛋白水平显著增加,反映了α-突触核蛋白的聚集(图2B),这通过观察纹状体中S129磷酸化-α-突触核蛋白阳性神经元突起和中脑内包涵体得到的。在注射了Syn PFF的小鼠模型中,用装载了anti-α-突触核蛋白shRNA-MCs的RVG-exosome处理30天后,有证据表明,与对照组相比,同侧中脑、纹状体和皮层的α-突触核蛋白mRNA水平仍下调了,但是在装载了anti-GFP shRNA-MCs的RVG-exosome处理组中α-突触核蛋白mRNA水平未受影响(图2A)。此时,装载了α-突触核蛋白shRNA-MCs的RVG-exosome治疗与3个同侧脑区中α-突触核蛋白的蛋白水平降低相关(图2B);特别是在注射Syn PFF后,纹状体中显著升高的α-突触核蛋白水平被降低到接近对照组的水平。

在第二组小鼠模型中,注射了Syn PFF后,用anti-α-突触核蛋白shRNA-MCs的RVG-exosome持续处理90天,以探讨该治疗对神经退行性过程的影响。这批小鼠除了在45天后需要再静脉注射一次以外,其余的和上面的处理方法一样,并在注射Syn PFF 90天后进行分析。在90天时,纹状体中Syn PFF注射分别与SNc中S129磷酸化-α-突触核蛋白阳性包涵体相关,与额叶皮层、躯体感觉皮层和躯体运动皮层相关及与杏仁核和纹状体相关(图3A和3B),而在对照小鼠中没有观察到包涵体,这与PFF诱导和α-突触核蛋白聚集的扩散一致。用载有anti-α-突触核蛋白shRNA-MC的外泌体处理90天后,额叶皮层、躯体感觉皮层、躯体运动皮层、杏仁核和SNc中的磷酸化-突触核蛋白阳性聚集明显下降(图3A-3B),但是在纹状体中变化不明显。

90天后,同侧和对侧大脑所有3个区域的α-突触核蛋白mRNA水平均较低(图4A-4B)。这种减少在同侧中脑(与对照组相比减少了37%,p = 0.039)和皮层(与对照组相比减少了47%,p < 0.001)以及对侧中脑(与对照组相比减少了42%,p = 0.027)中具有统计学意义。对侧区域中α-突触核蛋白mRNA水平的长期下降与所有3个区域中较低水平的α-突触核蛋白相关,这在中脑(与对照组相比降低了60%,p = 0.033)和皮层中具有统计学意义(与对照组相比降低了55%,p = 0.039)(图4D)。然而,在同侧区域中,只有中脑中的α-突触核蛋白仍然显著下降(与对照组相比下降54%,p = 0.043)。在纹状体和皮层,α-突触核蛋白水平与对照组相似(图4D);这可能反映了在同侧大脑中α-突触核蛋白的聚集(图3A和3B)情况。

注射Syn PFF的小鼠表现出多巴胺能神经支配的单侧缺失,前、中和后层的酪氨酸羟化酶(TH)染色分别减少了21%(p <0.001)、41%(p <0.001)和 56%(p <0.001)(图5A)。多巴胺转运体(DAT)免疫染色证实多巴胺神经支配缺失,前、中、后三层染色分别减少13% (p = 0.025)、27% (p < 0.001)和48% (p < 0.001)。对中脑TH阳性染色神经元评估显示,注射了Syn-PFF的小鼠在单侧SNc中多巴胺能神经元缺失30%(p=0.002)(图5B)。在30、60和90天时,使用负趋地性和钢丝垂悬试验评估了运动表现力。与之前的研究结果一致,90天后,经Syn-PFF处理的小鼠在负趋地性试验(p=0.047)和钢丝垂悬试验(p=0.036)中表现出显著的下降(图5C和5D)。

用载有anti-α-突触核蛋白shRNA-MC的外泌体处理会减少与Syn PFF治疗相关的多巴胺能神经元损失,其水平与对照组相似(相对于Syn PFF小鼠,细胞损失抑制率为75%,p = 0.028)( 图5B)。这与纹状体中Syn PFF诱导多巴胺能末端的丢失具有显著的保护作用有关(图5A)。病理学上的这些改善与90天时的临床参数改善有关,Syn-PFF小鼠注射了载有anti-α-突触核蛋白的外泌体后,其表现与对照组小鼠没有区别(图5C和5D)。

为了评估载有anti-α-突触核蛋白的外泌体疗法是否能影响炎症反应,将注射了Syn PFF 90天后的小鼠脑切片用anti-Iba1抗体染色,并评估阳性细胞的数量和形态。活化的小胶质细胞的数量和大小通常会随着过程的缩短和结块而增加,并且可以使用Colburn进行定性评估。纹状体注射Syn PFF 与S129磷酸化-α-突触核蛋白包涵体的区域中Iba-1阳性细胞数量和平均大小的不显著增加有关。
为了评估重复治疗对炎症标志物的影响,作者分析了载有anti-α-突触核蛋白的外泌体处理后血清中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6和IL-12p70的水平。这些细胞因子的水平在Syn-PFF注射小鼠或Syn-PFF并载有shRNA-MC处理的小鼠中均未显著升高。这证实了与Syn-PFF小鼠相比,两剂anti-α-突触核蛋白的外泌体疗法没有激活小鼠的免疫应答。
结论:

本文阐释了用RVG exosomes递送MC结构在体内的治疗潜力。通过靶向外泌体特异性递送shRNA-MCs来下调基因表达的方法,不仅是PD的潜在疗法,也是其他神经退行性疾病和组织特异性疾病(如阿尔茨海默病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症)的治疗方法。这项新疗法将为这些进行性神经退行性疾病提供完全不同的疗法,并且因此改变患有这些疾病的人们的生活。

参考文献

[1] Izco M, et al. Systemic Exosomal Delivery of shRNA Minicircles Prevents Parkinsonian Pathology. 2019.08.010. Epub 2019 Aug 27.


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