药物载体|外泌体递送shRNA小环可治疗帕金森病
帕金森病(PD)是世界上第二大常见的神经退行性疾病,但目前仍缺乏有效的疾病治疗方法。在家族性帕金森病中,α-突触核蛋白基因(SNCA)发生了大量突变和倍增,且全基因组关联研究(GWAS)已经发现SNCA位点是潜在的PD危险因素。在所有PD病人的路易斯小体中,我们观察到α-突触核蛋白聚集比较明显,因此α-突触核蛋白在PD发病中起着重要的作用。
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PD治疗可以借助基因疗法实现,即使用一个精准有效的传递系统将干扰α-突触核蛋白基因的分子(siRNA或shRNA)递送到中枢神经系统(CNS),且能较长时间内降低基因表达以治疗疾病。本文作者将狂犬病毒糖蛋白(RVG)肽修饰在外泌体(Exosomes)表面,形成RVG-exosomes,作为特定靶向大脑的分子载体,同时作者选了一种小环状的shRNA(shRNA-MC)用于干扰α-突触核蛋白基因。结果表明,将装载了shRNA-MC的RVG-exosomes注射入大脑后可以诱导脑内蛋白表达的长期下调,故可以作为一种有效的PD治疗手段。此种方法也可以用于其他神经退行性疾病的治疗。
Graphical Abstract
1. RVG-exosomes装载shRNA-MCs的条件优化与验证
从转染了RVG-Lamp2b的原代树突状细胞的条件培养基中分离出RVG-exosomes,再优化shRNA-MCs和RVG-exosomes的装载条件。作者将1ug anti-GFP shRNA-MCs装载入3ug RVG-exosomes,装载效率用SH-SY5Y细胞中GFP表达下调情况来评估。实验结果表明使用电穿孔方法且条件为450V-100mF时GFP被敲低的效果较为明显。随后检测了电转后外泌体的大小仍属正常范围内,及用DNase 保护检测实验证明了shRNA-MCs的确存在于外泌体内(图1A)。
在GFP表达的SH-SY5Y细胞中,作者通过不同的递送方式研究anti-GFP shRNA-MCs对GFP表达下调的效果,并与肌动蛋白水平进行比较(图1B)。实验结果显示,与对照组相比,细胞用X-tremeGENE HP转染试剂转染了1ug GFP shRNA-MCs后,GFP蛋白下调了47%;细胞用纯化的电转了1ug anti-GFP shRNA-MCs 的RVG-exosomes处理,发现GFP蛋白下降了45%,这与细胞用装载了GFP shRNA-MCs的RVG-exosomes后再用DNA酶处理了未封装DNA的效果相似。
为了研究CNS中shRNA-MC RVG-exosomes下调基因表达的能力,作者分别将150ug RVG-exosomes电转了不同浓度的anti-GFP shRNA-MC(100ug或150ug MCs)静脉注射入过表达GFP的转基因小鼠。30天之后,GFP蛋白水平在嗅球和中脑区域明显降低,而在装载了150ug MC的外泌体处理组,其GFP蛋白下降总是更高。从电转化的RVG exosomes (150ug shRNA-MCs和150ug RVG-exosomes)中提取anti-GFP shRNA- MC构建体,发现RVG-exosomes中shRNA-MC DNA的回收率为19%±5% (30ug shRNA-MCs/150ug exosomes)。
作者的研究结果说明,anti-GFP shRNA-MCs可以成功装载到RVG-exosomes中,在静脉注射后至少30天在选定的大脑区域中能下调GFP蛋白水平。
作者用在朊病毒启动子下表达了磷酸化人S129D α-突触核蛋白-HA的转基因小鼠模型来研究含有anti-α-突触核蛋白shRNA-MCs的RVG-exosomes在体内下调α-突触核蛋白的递送效率。该模型从3个月大开始就在整个大脑中展现出α-突触核蛋白的聚集体。
作者分别将电转了anti-α-突触核蛋白shRNA-MCs(150ug)和anti-GFP shRNA-MCs(150ug,对照组)的RVG-exosomes (150ug)采用静脉注射注入10-14周大的转基因小鼠中,注射后45天处死小鼠并检测α-突触核蛋白mRNA和蛋白水平。实验结果显示,注射了载有anti-α-突触核蛋白shRNA-MCs的RVG-exosomes实验组表现出所有研究区域中S129D α-突触核蛋白-HA mRNA水平下调,其中在中脑区、皮层、纹状体和脑干显著降低,但是注射了载有anti-GFP shRNA-MC的RVG-exosomes处理组中没有一致的变化趋势(图1D)。在α-突触核蛋白shRNA-MCs实验组中,在所有研究的区域中S129D α-突触核蛋白-HA蛋白水平均低于对照组,其中在嗅球和中脑区下降较为显著(图1E),因此数据显示在CNS这种治疗可以实现长期下调α-突触核蛋白的潜能。
3. 用载有α-突触核蛋白shRNA-MCs的RVG-Exosomal处理可预防PD的Syn PFF小鼠模型中的神经退化
90天后,同侧和对侧大脑所有3个区域的α-突触核蛋白mRNA水平均较低(图4A-4B)。这种减少在同侧中脑(与对照组相比减少了37%,p = 0.039)和皮层(与对照组相比减少了47%,p < 0.001)以及对侧中脑(与对照组相比减少了42%,p = 0.027)中具有统计学意义。对侧区域中α-突触核蛋白mRNA水平的长期下降与所有3个区域中较低水平的α-突触核蛋白相关,这在中脑(与对照组相比降低了60%,p = 0.033)和皮层中具有统计学意义(与对照组相比降低了55%,p = 0.039)(图4D)。然而,在同侧区域中,只有中脑中的α-突触核蛋白仍然显著下降(与对照组相比下降54%,p = 0.043)。在纹状体和皮层,α-突触核蛋白水平与对照组相似(图4D);这可能反映了在同侧大脑中α-突触核蛋白的聚集(图3A和3B)情况。
注射Syn PFF的小鼠表现出多巴胺能神经支配的单侧缺失,前、中和后层的酪氨酸羟化酶(TH)染色分别减少了21%(p <0.001)、41%(p <0.001)和 56%(p <0.001)(图5A)。多巴胺转运体(DAT)免疫染色证实多巴胺神经支配缺失,前、中、后三层染色分别减少13% (p = 0.025)、27% (p < 0.001)和48% (p < 0.001)。对中脑TH阳性染色神经元评估显示,注射了Syn-PFF的小鼠在单侧SNc中多巴胺能神经元缺失30%(p=0.002)(图5B)。在30、60和90天时,使用负趋地性和钢丝垂悬试验评估了运动表现力。与之前的研究结果一致,90天后,经Syn-PFF处理的小鼠在负趋地性试验(p=0.047)和钢丝垂悬试验(p=0.036)中表现出显著的下降(图5C和5D)。
本文阐释了用RVG exosomes递送MC结构在体内的治疗潜力。通过靶向外泌体特异性递送shRNA-MCs来下调基因表达的方法,不仅是PD的潜在疗法,也是其他神经退行性疾病和组织特异性疾病(如阿尔茨海默病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症)的治疗方法。这项新疗法将为这些进行性神经退行性疾病提供完全不同的疗法,并且因此改变患有这些疾病的人们的生活。
参考文献:
[1] Izco M, et al. Systemic Exosomal Delivery of shRNA Minicircles Prevents Parkinsonian Pathology. 2019.08.010. Epub 2019 Aug 27.
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