膀胱癌（BCa）作为全球最常见的恶性肿瘤之一，是男性癌症相关死亡的主要原因，2018年估计新增55万病例和2万人死亡。BCa患者的预后与淋巴结（LN）转移密切相关，其5年生存率从77.6%下降到18.6%，但是BCa中引发淋巴结转移的分子机制仍不清楚。
研究报道由肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）产生的VEGF-C在BCa淋巴管生成和淋巴结转移中起重要作用。此外，PROX1对淋巴管系统的形成、调节内皮细胞的分化和诱导淋巴管内皮细胞的淋巴出芽和延伸也起到关键作用。然而，癌细胞促进淋巴管生成和PROX1上调的确切机制仍需要进一步探究。
外泌体是一类粒径大小为30-150nm的微小囊泡，内容物含有各种核酸组分，包括mRNAs、miRNAs、lncRNAs。最近有研究表明癌症细胞分泌的外泌体是细胞间通讯的关键信使，与癌症引起的血管通透性、炎症等相关。
近日，中山大学孙逸仙纪念医院的林天歆课题组报道了一种lncRNA，LINC00858，被称为淋巴结转移相关转录物2（LNMAT2），在BCa组织中过表达，同时也在BCa患者的尿液外泌体（urinary-EXO）中大量富集，且与淋巴结转移呈正相关。外泌体LNMAT2能在体内外促进淋巴管生成和LN转移。机制上，装载到外泌体中的LNMAT2与异质核糖核蛋白A2B1（hnRNPA2B1）直接相互作用，并被传递到人淋巴管内皮细胞（HLECs）。随后，LNMAT2通过诱导hnRNPA2B1介导的H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）与PROX1启动子形成三聚体，增强PROX1转录，从而BCa中促进淋巴管生成和LN转移。
作者通过二代测序（NGS）技术分别测不同组织中的lncRNAs表达情况，即5例BCa患者中高度肌肉侵袭性膀胱癌（MIBC组织）和癌旁组织（NATs），5对LN阳性和LN阴性的BCa组织。数据分析显示，与NATs相比，LNMAT2在MIBC组织中表达增加了3倍以上；与LN阴性组织相比，LN阳性组织中LNMAT2表达也提高了3倍以上。随后作者用266个BCa患者的膀胱癌组织和癌旁组织进行实时定量PCR（qRT-PCR），结果进一步证实了LNMAT2在膀胱癌组中呈现过表达现象。随后，通过RACE、FISH等实验对LNMAT2的特征进行阐述，LNMAT2位于染色体10q23.1，全长为3187nt，定位于BCa细胞的胞质中。此外，作者通过对266个BCa患者的检测数据分析，发现BCa患者的LNMAT2表达与LN转移呈正相关（Figure 1A）。Kaplan-Meier曲线分析揭示了LNMAT2过表达会使BCa患者有较短的总生存期（OS）和无病生存率（DFS）（Figure 1，B和C）。原位杂交（ISH）结果表明LNMAT2在LN阳性的BCa组织中显著上调，在LN阴性的BCa组织中有稍许增加，在NATs中几乎检测不出（Figure 1，D和E）。重要的是，LNMAT2表达也与淋巴管密度呈正相关，可以用淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE-1）进行观察，但是BCa中没有看到LNMAT2和VEGF-C表达之间的相关性（Figure 1，F-H）。
Figure 1 LNMAT2过表达与BCa淋巴转移有相关性由于胞外lncRNAs主要包裹在特定的亚细胞结构中，尤其是外泌体，且在介导细胞间相互作用和促进肿瘤淋巴结转移方面具有重要的生物学功能，故作者检测了BCa细胞分泌的外泌体中LNMAT2表达水平。作者用qRT-PCR分析了206例BCa患者和120例健康对照者的尿液样本中分离的外泌体，发现与健康对照组相比，从BCa患者获得的尿液EXO中LNMAT2水平上调(Figure 2A),这表明了外泌体LNMAT2对BCa的发展至关重要。随后作者进一步检测了从BCa细胞系(5637和UM-UC-3)的培养上清中分离的外泌体中LNMAT2的表达。为了证实从培养上清中分离得到的颗粒是外泌体，作者分别用透射电镜（TEM）鉴定外泌体的杯状形态（Figure 2B）、Nanosight分析外泌体的大小（Figure 2C）和WB检测外泌体的特定标志物（CD9和CD63）（Figure 2D）。在5637和UM-UC-3细胞系中LNMAT2表达显著上调，同时LNMAT2在BCa细胞分泌的外泌体中富集量与细胞表达量相关，这揭示了LNMAT2主要以外泌体形式发挥其作用（Figure 2E）。过表达或干扰细胞中LNMAT2的表达同时会相应地上调或下调外泌体中LNMAT2的表达（Figure 2，H和I）。总之，上述结果表明了LNMAT2在BCa细胞分泌的外泌体中大量富集。
Figure 2 LNMAT2水平在BCa细胞分泌的外泌体中显示上调
3.BCa细胞分泌的外泌体LNMAT2可在体外促进淋巴管生成
作者将BCa细胞分泌的外泌体与HLECs细胞共孵育，检测发现与对照组相比，BCa细胞分泌的外泌体能显著促进HLEC的成管和迁移能力（Figure 3，A-C）。由过表达LNMAT2细胞分泌的外泌体能强烈诱导HLEC的成管和迁移（Figure 3，D-F），而由干扰LNMAT2细胞分泌的外泌体失去了其诱导HLEC的成管和迁移的能力（Figure 3，G-I）。
Figure 3 外泌体LNMAT2能在体外促进淋巴管生成作者将luciferase标记的UM-UC-3细胞移植到裸鼠的脚垫处，并把裸鼠随机分成3组，随后进行瘤内注射，3组注射剂分别为PBS（control）、转染了空载体的UM-UC-3细胞分泌的外泌体（UM-UC-3-EXOvector）、转染了带有LNMAT2的UM-UC-3细胞分泌的外泌体（UM-UC-3-EXOLNMAT2）。当原发肿瘤达到200mm3，切除肿瘤和腘窝淋巴结进行分析（Figure 4A）。结果发现，与对照组或UM-UC-3-EXOvector相比，UM-UC-3-EXOLNMAT2能显著提高BCa细胞向LNs转移的能力（Figure 4，B和C）。UM-UC-3-EXOLNMAT2组中腘窝淋巴结的体积也比对照组或UM-UC-3-EXOvector的大（Figure 4，D和E）。萤光素酶免疫染色实验也表明了UM-UC-3-EXOLNMAT2组中外泌体的LNMAT2能提高BCa细胞向LNs转移的能力（Figure 4，F和G）。
Figure 4 外泌体LNMAT2能在体内促进淋巴结转移随后，作者研究了外泌体LNMAT2的体内致瘤能力，即小鼠皮下接种UM-UC-3细胞，并将小鼠随机分为3组，再向每组分别瘤内注射PBS、UM-UC-3-EXOvector和UM-UC-3-EXOLNMAT2，每3天注射一次，连续5周（Figure 5A）。结果发现，与UM-UC-3-EXOvector组和PBS组相比，UM-UC-3-EXOLNMAT2促进了肿瘤的生长（Figure 5，B-D），体现在肿瘤的大小、重量及增殖marker Ki67的检测上（Figure 5，E-H）。上述数据揭示了BCa细胞分泌的外泌体LNMAT2能在体内促进淋巴管生成和LN转移。Figure 5 外泌体LNMAT2能在体内促进BCa淋巴管生成作者用RNA pull-down实验获得了一个明显的35-40kDa条带（Figure 6A），经质谱（MS）证实是hnRNPA2B1（Figure 6B），通过WB检测也说明了LNMAT2特异地与hnRNPA2B1结合（Figure 6，C和D）。此外，LNMAT2 FISH和hnRNPA2B1免疫染色实验结果显示了LNMAT2和hnRNPA2B1主要集中在BCa细胞的胞质中（Figure 6E）。RNA免疫沉淀（RIP）结果验证了LNMAT2和hnRNPA2B1之间的相互作用（Figure 6F）。随后通过序列分析进一步寻找到LNMAT2和hnRNPA2B1相互作用的区域（Figure 6K）。 Figure 6 LNMAT2与hnRNPA2B1直接相互作用
6.hnRNPA2B1介导LNMAT2包装进外泌体
作者想验证LNMAT2与hnRNPA2B1之间的相互作用是否能促进LNMAT2包装进外泌体，于是，作者将hnRNPA2B1敲低，发现BCa细胞分泌的外泌体LNMAT2水平降低，而BCa细胞中LNMAT2水平没有变化。随后，通过突变LNMAT2与hnRNPA2B1之间的结合位点，证明了hnRNPA2B1与这些结合位点之间的相互作用对于LNMAT2包装成外泌体很重要（Figure 7B）。此外，与miR-18a相比，这是一种只在细胞中存在，而外泌体中没有的miRNA，LNMAT2呈现了较高的外泌体-细胞的比率（Figure 7C）。hnRNPA2B1敲低后显著降低了BCa细胞分泌的外泌体中LNMAT2和miR-98富集水平（Figure 7D），这表明了LNMAT2以hnRNPA2B1依赖的方式特异性地包装进外泌体。
7.外泌体LNMAT2能被HLECs吸收并诱导其淋巴管生成
作者将纯化的外泌体进行PKH67绿色荧光标记，并与HLECs孵育12h。共聚焦图片显示受体细胞HLECs胞质中有绿色荧光信号，而对照组中没有观察到PKH67荧光信号（Figure 7E）。此外，作者发现HLECs与外泌体共孵育后，其LNMAT2表达显著提高（Figure 7F）。 作者用CRISPR/Cas9方法敲除了HLECs中LNMAT2，建立了LNMAT2-KO细胞系，再进行LNMAT2缺失检测，表明内源性LNMAT2表达成功被抑制（Figure 7H）。随后再考察外泌体LNMAT2对LNMAT2-WT和LNMAT2-KO细胞的影响，通过成管和Transwell实验发现，与转染了干扰对照组（si-NC）5637细胞分泌的外泌体（5637-EXOsi-NC）相比，转染了si-LNMAT2#1的5637细胞分泌的外泌体能降低LNMAT2-KO HLEC的增殖和迁移（Figure 7，I-K）。上述这些结果表明，BCa细胞通过向HLECs传递外泌体LNMAT2来诱导淋巴管生成。
Figure 7 LNMAT2以hnRNPA2B1依赖的方式包装入外泌体中并传递到HLECs
8.外泌体LNMAT2独立于VEGF-C上调PROX1表达
之前的文献报道了肿瘤细胞和TAMs产生的VEGF-C有助于BCa中淋巴管生成和LN转移，然而，20%以上伴有淋巴结转移的BCa呈低VEGF-C表达。作者的研究结果显示，无论是LNMAT2过表达还是LNMAT2敲低，5637和UM-UC-3细胞中VEGF-C的mRNA或蛋白水平基本都没有改变，这也说明了BCa中LNMAT2诱导的淋巴管生成和LN转移可能通过一种独立于VEGF-C的机制而发生的。有研究报道，PROX1通过调节内皮细胞分化和转移，对淋巴管系统的发育比较重要。有趣的是，与对照组相比，用外泌体LNMAT2处理HLECs，其PROX1表达显著提高（Figure 8，A和B），表明在HLECs中外泌体LNMAT2能上调PROX1表达。
9.外泌体LNMAT2能与PROX1启动子形成DNA-RNA三聚体
作者研究发现，外泌体LNMAT2大量富集到HLECs的细胞核中，随后通过萤光素酶和CHIRP实验证明了外泌体LNMAT2与HLECs中PROX1启动子的P3（-607bp至-597bp）区域相互作用（Figure 8，C-F）。为了进一步研究LNMAT2是否直接与PROX1启动子相互作用，作者使用LongTarget工具获得了5对潜在的三聚体形式的寡核苷酸（TFOs）和它们对应的三聚体目标位点（TTSs），并且每个结合位置可以用荧光共振能量转移（FRET）分析和圆二色性（CD）光谱检测。经过多个实验验证，说明了外泌体LNMAT2可通过与hnRNPA2B1直接作用以增强PROX1启动子的H3K4me3水平，从而上调PROX1表达（Figure 8）。
Figure 8 外泌体LNMAT2与PROX1启动子形成一种DNA-RNA三聚体
10.外泌体LNMAT2与hnRNPA2B1相互作用，以促进PROX1启动子处的H3K4三甲基化
作者探讨了HLECs中hnRNPA2B1是否通过调节PROX1启动子区域的H3K4me3水平而参与外泌体LNMAT2诱导的PROX1转录激活。用5637-EXOLNMAT2、UM-UC-3-EXOLNMAT2和5637-EXOsi-LNMAT2#1分别处理HLECs，结合CHIP实验，发现外泌体LNMAT2能与hnRNPA2B1直接相互作用并增加PROX1启动子区H3K4me3水平，从而上调PROX1表达水平。
11.外泌体LNMAT2诱导引起PROX1上调促进淋巴转移
接下来，作者减少外泌体中LNMAT2表达，会使肿瘤诱导的HLEC增殖、迁移功能随之降低（Figure 9，A-C）。而干扰PROX1会显著消除外泌体LNMAT2引起的HLEC成管和迁移现象，并且是独立于VEGF-C的方式，因此，PROX1对于体外外泌体LNMAT2介导的独立于VEGF-C而引起淋巴管生成和淋巴结转移是必需的。此外，体内实验表明，经过VEGF-C中和抗体处理后，与UM-UC-3-EXOvector组相比，UM-UC-3-EXOLNMAT2组腘窝LNs体积更大（Figure 9，D-F）。小鼠BCa组织的IHC结果也说明了LNMAT2高水平时，肿瘤内和肿瘤周围区域的LYVE-1阳性淋巴管中PROX1表达均升高（Figure 9，G-I）。这些数据进一步证明，外泌体LNMAT2上调PROX1表达，以VEGF-C无关的方式诱导BCa淋巴转移。Figure 9 PROX1是外泌体LNMAT2介导的淋巴管生成所必需的
12.外泌体LNMAT2与BCa患者的淋巴结转移有关
作者发现在另外206例患者的检测中，LNMAT2过表达与BCa组织瘤内和瘤周围区域淋巴管密度增加有关（Figure 10，A和B）。ISH结果显示，当BCa患者中外泌体LNMAT2高表达时，肿瘤组织中LNMAT2水平也会显著升高，这表明外泌体LNMAT2在与LNMAT2相关的BCa淋巴结转移中起重要作用。随后，作者考察外泌体LNMAT2是否与BCa淋巴结转移相关。有淋巴结转移的BCa患者的外泌体LNMAT2表达明显高于无淋巴结转移的BCa患者（Figure 10C）。此外，Kaplan-Meier分析显示外泌体LNMAT2表达水平高与BCa的不良预后有关（Figure 10，D和E）。受试者工作特征曲线（ROC）分析显示，尿液中的外泌体LNMAT2可区分BCa患者于健康对照组，且AUC曲线对于BCa淋巴结转移的准确性判断更高（Figure 10，F和G）。同时，作者也检测了血清中外泌体LNMAT2水平，也发现LN转移的BCa患者血清中外泌体LNMAT2表达显著提高。综上所述，作者的结果表明，外泌体LNMAT2可能是BCa患者LN转移的一个潜在诊断标志物和治疗靶点（Figure 10H）。
Figure 10外泌体LNMAT2与BCa患者的淋巴结转移有关
结论
在本篇文章，作者发现了BCa中外泌体lncRNA介导了一个与VEF-C无关的LN转移机制，并且鉴定LNMAT2可以作为BCa淋巴转移的一个治疗靶点。J Clin Invest. 2020 Jan 2;130(1):404-421. Exosomal long noncoding RNA LNMAT2 promotes lymphatic metastasis in bladder cancer.