十问十答|一文秒懂10x Genomics单细胞测序黑科技

Q1、 为什么要做单细胞测序研究？A大家知道，世界上没有两片相同的叶子。对于多细胞生物来讲，尽管来自于一个受精卵，但随着个体的发育，细胞逐渐分化成不同的亚群，它们各自表达不同的遗传信息，行使不同的生理功能。对于同一个组织，相邻的细胞之间也存在异质性，比如脑组织、心脏组织。特别的，肿瘤是一个突变细胞的大杂烩，笼统地对肿瘤组织和微环境细胞进行基因分析（bulk phase sequencing），不同细胞的混合测序很可能掩盖某些关键的信息。而单细胞测序可以完美解决这个问题，它极大提高了测序分析的分辨率，使得遗传信息精确到单细胞水平，为个体发育与疾病研究等提供了强有力的帮助。2013-2020 年，单细胞测序技术多次被 Science、Nature 等学术期刊评价为年度重点技术，正引领新一轮生物医学领域的技术革命。

Q2、 单细胞测序技术的平台都有哪些？A单细胞测序领域自从2009年开始，稳步上升，近几年也出现井喷式的发展（图1）。这得益于科研人员在单细胞技术上面的突破，另外商业化平台的推出也降低了单细胞测序的门槛。图1 | 单细胞RNA测序技术概览

基于单细胞分选方式的不同，我们可以把单细胞测序技术分为特异性和非特异性两种。其中特异性分选技术包括微吸管分离、激光捕获显微分离和荧光激活细胞分选三种。小编这里主要给大家介绍三种商业化的高通量非特异性分选平台。

第一种是Fluidigm公司的C1平台(图2)，采用微流控芯片技术。2012年6月13日，Fluidigm 在日本横滨举行的国际干细胞研究学会 (ISSCR ) 上发布了C1 单细胞全自动制备系统，是真正第一个实现商业化的平台。但是它一张芯片最多可实现96或800个细胞的核酸样本制备，通量较低，相对提高了单个细胞的成本，这也严重制约了它的发展。

图2 |  Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统

第二种是BD公司的Rhapsody平台（图3），采用CytoSeq特有的微孔（蜂窝板）技术，使用20W+的微孔对单细胞进行捕获。它的原理是控制细胞的投入量，使其以一定比例的单细胞形式掉落到微孔中，然后再加入微磁珠进行反应。这种方式单次可以制备数百到数千个单细胞文库。

图3 | Rhapsod™单细胞分析系统

第三种是大家熟知的10x Genomics平台（图4），基于Drop-Seq技术，使用液滴法形成隔离单细胞的腔室。它的原理是在微流控芯片中将带有barcodes的凝胶珠和单细胞结合形成微油滴（GEM,Gel bead in emulsion），微油滴内单细胞裂解后进行逆转录反应；破油后进行cDNA 扩增和建库；同时可以进行上千个细胞的转录组分析。

图4 | 10x  Chromiums单细胞基因表达平台

Q3、 10x Genomics的优势是什么？Aa、简单便捷：集单细胞分选、扩增、建库于一体；
b、细胞通量高：每个样本细胞数可达500-10000个；
c、建库周期短：2.5天可完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增及建库；
d、超高捕获效率：单细胞捕获效率高达65%；
e、真正意义的单细胞：单个液滴捕获到多个细胞的概率极低。（0.9%/1000cells）；
f、价格实惠：相较于其它单细胞平台，价格实惠，单个细胞成本低于10元，远低于SMART-SEQ。

Q4、 目前10x Genomics的单细胞产品有哪些？A

10x Genomics公司使用基于10x Next GEM技术的Chromium系统，可以提供多种单细胞解决方案。包括针对基因表达的“单细胞转录组”，针对DNA水平的“单细胞CNV-seq”，针对蛋白水平的”feature barcode 表面蛋白检测“，针对免疫分析的“单细胞免疫组库（V(D)J-seq）”，以及针对表观方向的”单细胞ATAC-seq“。

Q5、 10x Genomics转录组的实验流程是什么？A

将待测样本制成的单细胞悬浮液与含有barcode信息的凝胶珠（图5b）以及酶的混合物结合，然后在微流体中进行液滴包裹，从而形成GEMs（图5a），有效GEMs中包含胶珠（胶珠中有预制的10x引物）、单细胞、和Master Mix。然后，在GEMs内进行细胞裂解和逆转录反应（图5c）。有效GEMs中，10x Barcode将与cDNA产物连接在一起，接下来再将GEMs破碎并打碎油滴，以cDNA为模板进行PCR扩增，cDNA扩增完成以后，针对扩增产物进行质检（扩增片段大小以及扩增产物的产量）。

之后将合格的cDNA产物进行测序文库的构建，首先片段化酶将cDNA片段化，再进行末端修复和加A；cDNA片段筛选后进行 Adaptor连接;并通过PCR扩增引入样品Index，最后进行片段筛选从而得到文库（图5d）。

最后对文库进行质检，库检合格以后，利用Illumina测序平台获得测序数据，再进行数据分析。

图5 | 10x单细胞转录组详解

Q6、 单细胞转录组实验的质控标准是什么？Aa、 我司单细胞解离的质控标准为：
①  细胞活率＞90%；
② 细胞结团率＜5%；
③ 活细胞浓度范围: 300 ~ 1200 cells/μl；
④ 有核率＞70%；    
⑤ 细胞直径范围: 5~30 μm；          
⑥  细胞悬液体积＞100 μl。
b、 我司对cDNA扩增产物及文库进行质检，标准如下：
① cDNA扩增产物跨度为200–9000 bp且在1000-2000bp左右有明显主峰（图6a），总量至少满足一次建库用量；
② 文库跨度为300-700bp之间且在400-500bp左右有明显主峰（图6b），无接头、引物二聚体和大片段污染。

图6 | 10x单细胞转录组 cDNA及文库质控图

Q7、 单细胞转录组的基本分析内容有哪些？A① 测序数据质量评估
② 基因表达量确定
③ tSNE降维聚类分析
④ 细胞亚群鉴定
⑤ Marker gene鉴定
⑥ 细胞分化轨迹分析

Q8、 单细胞转录组的应用领域有哪些？A

① 肿瘤异质性研究：解析肿瘤组织的细胞异质性，对肿瘤耐药性、预后变化及癌症发证和发展机理提供技术支持；
② 免疫方向研究：精确分析免疫细胞的遗传物质多样性，鉴定稀有的免疫细胞类型，辅助发现Marker基因；
③ 发育分化：解析心脏、大脑、胚胎等组织细胞的异质性，洞察组织分化过程中的细胞群体变化，挖掘分子机制；
④ 图谱构建：构建人类、鼠等全部细胞的转录组图谱

Q9、 百迈客可以做哪些物种组织的单细胞转录组测序？A10x单细胞技术需要高质量的参考转录本，可以研究真核生物带有polyA结构的RNA。目前百迈客搭建了一支经验丰富的单细胞团队，在单细胞解离方面有丰富的经验，目前已成功解离人、鼠等各类组织，包括：
人：脑、视网膜、甲状腺、心脏、脾脏、肺、肾脏、胃、胆管、血液、各类肿瘤等
鼠：脑、海马体、骨骼肌、肺、卵巢、睾丸、肝脏、胰腺等；
植物：拟南芥根、番茄等
其他：羊胃&肌肉、猪脾脏等

Q10、目前植物单细胞测序可以做吗？A

不同于动物单细胞测序，植物单细胞研究仍处于萌芽阶段。大家知道，受限于植物细胞壁的存在，需要制备原生质体后才能制备单细胞悬液；原生质体制备中的酶解时间及缓冲液渗透压问题一直困扰我们。另一方面，植物组织的细胞异质性较低，较难完成细胞分群。部分植物细胞的体积过大，也不适于采用10x Genomics平台进行单细胞测序研究。

当前植物单细胞研究主要集中于模式植物如拟南芥等，我司也在积极研发植物单细胞的实验流程，欢迎各位老师预约服务。

文：ZML

排版：市场部

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