英文题目：Exuberant fibroblast activity compromises lung function via ADAMTS4中文题目：过度活化的成纤维细胞通过表达ADAMTS4损害肺功能发表期刊：nature影响因子：42.778
纤维细胞位于感染的上皮细胞和免疫细胞的内皮进口点界面，可以通过改变局部组织环境来整合炎症信号和协调免疫反应。本研究通过对其进行单细胞和空间转录组数据分析，从而进一步加强对调控成纤维细胞ECM蛋白酶活性因子的研究，探寻一种靶向肺成纤维细胞ECM 蛋白酶活性损伤反应的治疗药物，从而为重症呼吸道感染预后保护肺功能和改善临床效果提供一种有效的方法。呼吸道感染是发病率和死亡率的主要原因。这些感染可导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)并引发肺水肿和缺氧，导致轻度到重度的呼吸衰竭。明确病原体清除和免疫病理之间的平衡机制，有助于改善ARDS预后效果。
研究表明治疗靶点主要包括肺ECM（细胞外基质） 的组成部分，主要由结构蛋白及降解或修饰ECM 的蛋白酶和糖苷酶组成。在肺受到损伤时，ECM 蛋白酶上调并重塑ECM ，促进免疫细胞向炎症部位迁移。非免疫肺细胞，包括上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞，均参与协调免疫反应直接介导肺功能。通过它们重构活性，特定的细胞群可以影响预后效果和长期后遗症。虽然关于免疫细胞如何调节宿主对呼吸道病毒感染的反应有大量的文献，但关于非造血细胞的异质性和作用的信息较少，因此本文将着重对其进行研究。
对感染甲型流感病毒的0、1、3和6天的小鼠CD45 -肺细胞进行单细胞基因表达谱(scGEX)分析，共鉴定三个主要群体：成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞(图1a、b)。高水平的病毒mRNA表明了主要在I型肺细胞、纤毛上皮细胞和II型肺细胞中检测到感染。成纤维细胞在感染后出现多种转录状态(图1c,d)。为了评估每个聚类中激活的通路，作者进行了基因集富集分析(GSEA)，将每个聚类与感染前几乎无差异表达基因的假定基线聚类(第5聚类)进行比较(图1c)。根据基因表达确定了三个主要的功能组：静息、ECM 合成和炎症(图1c)。ECM 合成成纤维细胞(ESFibs)丰富了编码ECM 结构蛋白的基因，但缺乏炎症信号(图1d)。炎性纤维母细胞表现出高表达的基因参与I型干扰素、白细胞介素- 6 (1L-6)和NF -κB信号通路， 而静息的成纤维细胞缺乏参与炎症反应或ECM 蛋白合成的通路的强富集。(图1e)。在炎性成纤维细胞中，作者确定了两种不同的激活状态，损伤反应成纤维细胞(DRFibs)和干扰素反应成纤维细胞(IRFibs)(图1d)。DRFibs丰富了参与组织损伤反应的通路，包括NF -κB信号和缺氧通路，而IRFibs丰富了I型干扰素应答途径(图1e,f)。通过对五个人肺活检的分析发现，成纤维细胞活化状态和在小鼠肺部与集群中定义的丰富ECM 合成、NF-κB信号和I型干扰素信号相类似。为了验证这些成纤维细胞激活状态，作者识别了在小鼠和人类肺部编码DRFibs和IRFibs中富集的表面蛋白标记基因(图1f)。Itga5的上调和Cd9的下调定义了DRFib的转录程序，而Bst2的上调和Cd9的表达定义了IRFibs程序(图1g)。在小鼠中，DRFibs的频率和数量在感染过程中增加，在12天左右达到高峰(图1g,h)；IRFibs出现迅速，到第3天频率逐渐下降(图1h)。ITGA5hiCD9lo成纤维细胞高表达DRFib标签基因(Lox和Adamts4)，而ITGA5hi CD9lo成纤维细胞表现出静息的表型，感染诱导基因低表达。IL-1和TNF刺激原发性肺成纤维细胞， NF -κB信号因子，高表达的TGA5，表明损伤反应的激活状态。对人肺活检的分析发现，成纤维细胞表现出与小鼠肺相似的表面表型。在死于呼吸衰竭的供体中存在损伤响应型活性成纤维细胞(ITGA5 hi CD9 lo)，但在健康供体中明显缺失。 Fig1. 严重甲型流感病毒感染期间CD45 -细胞的单细胞基因表达谱分析
接下来，进行调节成纤维细胞激活状态的上游刺激因子的识别。本文对正常人支气管上皮细胞(NHBEs) 进行体外感染季节性病毒(H3N2)或禽流感病毒(H5N6或H7N9)了测试，观察其是否足以在共培养的人肺成纤维细胞中驱动炎症转录 (图2a)。结果表明，NHBEs感染诱导成纤维细胞的炎症状态下具有丰富的基因表达，包括编码细胞因子的基因(IL6)和几种基质蛋白酶(ADAMTS4， MMP3和MMP13)。作者还测试了单个细胞因子和流感病毒在其自身培养的呼吸细胞中刺激这些转录程序的能力(图2a，单培养)，并将它们与流感病毒感染者的鼻腔清洗细胞(主要包括免疫细胞)进行比较，数据显示了ECM 相关基因的细胞类型特异性表达。与NHBEs相比，成纤维细胞对IL-1细胞因子和TNF的刺激反应强烈，ECM 相关基因广泛上调(图2a)。而ECM 相关基因编码结构蛋白和基质蛋白酶在鼻腔清洗细胞中表达较低。然而，IL1A、IL1B和TNF在鼻洗液和上皮细胞也表现出较高表达水平，表明它们可能向成纤维细胞提供免疫信号，从而调节ECM 相关基因的表达。
Fig2. ADAMTS4是一种由流感病毒感染诱导的肺纤维化源性ECM 蛋白酶
作者团队试图确定单个蛋白酶在生产性和非生产性肺修复中是否具有基本效应作用。文中评估了在流感病毒感染期间不同时间收集的小鼠肺匀浆中ECM 相关基因的表达调控(图2b)。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测到支气管肺泡灌洗液(BAL)中ECM 蛋白酶和组织抑制金属蛋白酶(TIMPs)与肺匀浆中基因表达动力学相关。在被检测的ECM 蛋白酶中，降解蛋白多糖的adamts4的表达是最容易被诱导的，并且在整个修复阶段都持续表达(图2b)。根据scGEX分析，Adamts4的表达局限于非免疫的基质细胞(图2c)。接下来对感染前后的免疫和非免疫人群进行了分类。感染前，Adamts4基因表达局限于成纤维细胞和内皮细胞。感染后，仅在成纤维细胞中观察到Adamts4表达量上调显著，这解释了在感染的肺部中Adamts4的表达量高的原因(图2d)。为了确定ADAMTS4基因表达在人类肺部疾病中的特异性，文中对7项关于肺纤维化、囊性肺疾病、过敏和哮喘以及病毒感染(伴有严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2))的研究中公开的scGEX数据集进行了meta分析。作为参考，作者纳入了一项由炎性成纤维细胞驱动的类风湿性关节炎的研究。ADAMTS4阳性细胞包括间充质细胞和内皮细胞，以及少量的上皮细胞和免疫细胞。ADAMTS4表达水平最高的成纤维细胞表现出激活的表型，且与DRFibs相关的基因表达丰富。对Habermann等人研究的数据分析，分析表明与健康对照组织相比，炎性肺疾病组织中ADAMTS4的表达明显增加。在每个细胞基础上，间充质细胞表达的ADAMTS4水平最高——至少比包括内皮细胞在内的其他细胞类型高一个数量级。与对照组相比，上皮细胞和免疫细胞中每个细胞的ADAMTS4水平都较低，患病肺中没有增加。为了确定成纤维细胞的反应在解剖学上的组织结构，文中对在呼吸窘迫高峰期(感染后10天(dpi))收集的小鼠肺切片进行了空间转录组分析。对转录谱进行聚类，识别出肺部区域(红色，0)与间质炎症区域重叠(图2e)。与DRFibs相关的基因，包括Itga5、Lox和Adamts4则在这些区域富集(图2e)。Adamts4的表达局限于肺泡附近的间质炎症区。在支气管区(绿色，2)、淋巴浸润密集区(青色，3)和正常肺泡实质区（黄色，1），DRFibs相关基因表达减少或缺失。总之，当宿主开始恢复或病情恶化时，在气道远端表达的Adamts4 是DRFibs的一个重要拐点。
Fig3. 在感染甲型流感病毒的小鼠中，ADAMTS4促进致命的免疫病理
为了确定ADAMTS4对感染结果的影响，作者用致死剂量的甲型流感病毒对Adamts4−/−和Adamts4+/+小鼠进行了实验。与Adamts4 +/+对照组相比，Adamts4−/−小鼠的存活率有所提高，这与肺部病毒无关(图3a,b)。在Adamts4−/−和Adamts4 +/+小鼠中，尽管存在细胞类型特异性差异，但感染细胞的频率和总数都没有实质上的差异。与野生型小鼠相比，根据动脉氧饱和度测定，Adamts4−/−小鼠的肺功能维持在6dpi(图3c)。在9 dpi时，Adamts4−/−小鼠的免疫细胞浸润和肺泡炎症显著减少，肺组织损伤程度较小(图3d)。与损伤减少相一致的是，与Adamts4 +/+对照组相比，Adamts4−/−小鼠BAL液中的总蛋白较少，肺匀浆中关键炎症介质(TNF和MCP-1)水平较低。通过利用气道阻力和动态肺顺应性测量， 这些组织损伤方面的差异转化为Adamts4−/−小鼠肺力学的改善(图3e)。作者检查了ADAMTS4缺乏对多功能蛋白聚糖水平的影响，多功能蛋白聚糖是ADAMTS4的主要底物。在炎症过程中，多功能蛋白聚糖是临时基质的重要组成部分，临时基质是一种松散的细胞外网络，引导细胞迁移、增殖和增殖分化；其功能取决于其降解状态和与其它ECM 蛋白之间的相互作用。与野生型小鼠相比，Adamts4−/−小鼠在感染后肺重构区域显示更高水平的完整多功能蛋白聚糖。在野生型或Adamts4−/−小鼠感染后，其他已知的多功能蛋白聚糖水平没有变化。由于CD8 + T细胞是甲型流感病毒感染期间免疫病理的主要驱动因素之一，作者评估了CD8 + T细胞在9dpi时肺的反应，即T细胞反应峰值和肺损伤的时间点。Adamts4−/−小鼠产生IFNγCD8 + T细胞的比例显著降低(图3 f)。在野生型和Adamts4−/−小鼠中，A型流感病毒特异性CD8 + T细胞的比例没有差异，这表明Adamts4−/−小鼠能够对A型流感病毒特异性T细胞产生类似于野生型小鼠的应答(图3 g)。作者观察到，与Adamts4 +/+小鼠相比，Adamts4−/−小鼠肺切片中的T细胞明显减少，在多功能蛋白聚糖高度完整的区域，T细胞大量缺失(图3h)。接下来，作者测试了纤维细胞来源的ADAMTS4是否能促进T细胞跨越多功能蛋白聚糖屏障迁移(图3i)。活化的CD8 + T细胞在有充分ADAMTS4成纤维细胞存在的情况下，以几乎相同的效率通过未包被膜和多功能蛋白聚糖包被膜迁移。相比之下，在有adamts4缺陷的成纤维细胞存在时，穿过多功能蛋白聚糖包被膜的迁移减少了40%以上。与DRFibs是ADAMTS4的主要生产者一致，DRFibs促进跨越多功能蛋白聚糖屏障的迁移，而在静息成纤维细胞和IRFibs存在时，迁移被抑制(图3j)，这突出了不同成纤维细胞激活状态的不同功能。
Fig4. ADAMTS4水平与严重的季节性和禽流感感染有关
接下来，作者在儿童重症流感(PICFLU)网络中调查了人类呼吸道中ADAMTS4对严重流感病毒感染的贡献。作者分析了84名被流感病毒感染的儿科患者在进入重症监护病房72小时内收集的气管内抽吸物标本(ETA)。在炎症介质中分析了ECM 蛋白酶和TIMPs的水平。对照年龄，作者发现ADAMTS4与IL-1B和TNF的水平呈正相关，IL-1B和TNF是ADAMTS4表达的上游调节因子，而IFNγ在甲型流感病毒感染期间ADAMTS4足量小鼠的CD8+T细胞中表达的频率更高(图4a)。接下来，作者使用三个指标测试ETA中ADAMTS4水平是否与流感相关疾病的严重程度相关：长时间多器官功能障碍综合征(PrMODS)或死亡，长时间急性缺氧性呼吸衰竭(PrAHRF)或死亡，无呼吸机天数少于10天(VFDs)。每个病例中，在控制了年龄、性别和基线健康状况后，ADAMTS4的浓度与疾病严重程度的结果显著相关。为了确定这些发现是否适用于成年人，作者分析了两个不同的样本，主要是成年人群：一个来自台北，代表季节性流感严重病例(37人)和一个从广州，代表严重的H7N9禽流感(16人)和季节性H1N1流感(14人)(扩展数据图10 d)。作者检测了来自多个呼吸室的样本(ETA，痰液和BAL液)。台湾组在症状出现后的单一时间点采样，而广州组在多个时间点采样。同一分析物的相关矩阵显示，在以成人为主的流感患者群体中，ECM蛋白酶、TIMP和细胞因子调节的模式相似(图4c)。作者测试了ADAMTS4是否与特定的呼吸道腔室有关，包括来自台湾的131个鼻洗液样本。在接受检测的鼻洗液样本中，有5%(131个样本中有6个)的样本能检测到很低水平的ADAMTS4，但在每个下呼吸道(LRT)腔室中，ADAMTS4的频率和浓度更高，这表明在感染期间，ADAMTS4的来源局限于LRT。 最后，作者测试了ADAMTS4是否是成人感染流感病毒期间疾病严重程度的预测因子。为了使数据与PICFLU队列相比较，作者关注最早可获得的ETA样本，当ETA样本无法获得时，仅包括第一批BAL液或痰样本(按顺序)。通过少于10个VFDs(比值比= 1.95，P=0.020)确定，ADAMTS4浓度的对数与疾病严重程度显著相关(图4d)。通过结合三个组群的样本，ADAMTS4浓度的对数与小于10的VFD值相关，包括年龄和性别作为潜在协变量(比值比=2.22，P=3.1×10−5)。基于这些结果，作者认为LRT中ADAMTS4蛋白水平是大范围严重流感病毒感染后低氧性呼吸衰竭和死亡率预测的的一个强有力的因子。在本研究中，作者证明肺成纤维细胞在组织中病毒感染部位协调免疫反应至关重要，从感染后不久开始，并持续到整个修复过程。在感染期间，肺成纤维细胞对受损的上皮细胞产生反应，传递炎症信号并修改ECM ，以产生一个促进对感染产生强健免疫反应的组织环境。最近的研究描述了ECM 蛋白酶在宿主对流感病毒应答中的保护和致病作用。虽然这些研究确定免疫细胞是ECM 蛋白酶的主要来源，但这里的数据表明，炎性成纤维细胞整合了来自上皮细胞和常驻免疫细胞的危险信号，从而产生多种炎性细胞因子、ECM 成分和降解酶，改变了局部组织环境。在小鼠中，肺缺乏ADAMTS4活性可保留完整的ECM 定位的多功能蛋白聚糖并调节免疫细胞迁移到感染区。先前的研究表明，完整的多功能蛋白聚糖能够抑制细胞毒性T细胞反应和抑制迁移。作者从人类参与者的研究中获得的数据表明，在大范围的年龄内，ADAMTS4是流感疾病严重程度的一个重要决定因素。在接受重症监护后不久收集的儿科组的气管内样本中，较高的ADAMTS4浓度是PrAHRF和PrMODS的强预测因子，在所有组中，LRT样本中较高的ADAMTS4浓度与较少的VDF有关。ADAMTS4在促进过度免疫病理方面的作用也需要在其他严重呼吸道感染(包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染)的背景下进行进一步研究。虽然目前尚无有效的治疗ARDS等呼吸道病毒感染严重并发症的药物，作者认为，可以通过限制过度炎症和维持肺组织的完整靶向损伤反应性成纤维细胞ECM蛋白酶、ADAMTS4的活性可能是治疗干预的合适靶点。
本文作者通过单细胞和空间转录组联合分析鉴定了肺损伤过程中的成纤维细胞的转录组表达图谱，并通过空间转录谱快速锁定间质炎症区域的靶分子Adamts4，揭示免疫反应的组织环境，从而为重症呼吸道感染预后保护肺功能和改善临床效果提供一种有效的方法。
文章中探讨了肺损伤炎症因子对免疫反应组织环境的改变，那么不免引发人考虑这种局部环境的改变是否也会改变免疫细胞的表型多样性？这种变化的程度有多大？能否加快免疫反应的过程？相信如果能够探索这些问题，就可以更加全面的了解免疫反应和微环境之间联系。那么我们又该如何研究免疫细胞表型的多样性呢？这里百迈客为大家带来了单细胞免疫组库-升级版2.0，使用chipK芯片和dual index，全新体验，性能更优。可以在单细胞水平同时检测转录组基因表达和TCR/BCR多样性，不但可以了解TCR/BCR克隆型，还可以联合转录组数据深入挖掘生命机理，为免疫组学研究提供更高效的平台。
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文：烟雨
排版：市场部