宏基因组测序在感染性疾病中的应用与反思
本文通过分析mNGS检测在不同病原微生物所致疾病中的应用，进一步探讨mNGS检测的优势及局限性，并提出可能的解决方案，使其能在感染性疾病诊治中发挥更重要的作用。
1 常用测序平台及测序原理
第一代测序技术由于对电泳分离技术的依赖，其测序速度较慢、成本较高，逐渐被NGS技术替代。NGS技术最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA片段进行序列测定，并且具有检测速度快、准确率高、成本低、覆盖面广等特点。目前常见的主要是Roche/454公司、Life Technologies公司和Illumina公司的测序平台。
454生命科学公司于2005年率先推出GS-20测序仪，标志高通量测序时代的到来，随后推出454GS-FLX、454GS-Jounior等机型。这些平台的测序原理都是乳液PCR技术，即先将待测DNA小片段化并在两端连接特定的"接头"；再将带有引物和必要PCR物质的乳液微球与小片段DNA进行混合、扩增，并尽量保证每个乳液微球作为独立反应器只结合一条小片段DNA，即实现在每个乳液微球内部的单克隆扩增；最后对这些乳液微球进行富集，同时添加4种dNTPs和荧光素酶等进行扩增，并释放特定可见光信号，用相应仪器收集，将光信号转化为测序峰从而达到测序目的。
Life Technologies公司收购ABI公司后推出SOLiD系列测序平台，也利用乳液PCR技术进行测序。SOLiD平台的创新之处在于应用双碱基编码技术，即扩增过程中每个碱基被阅读两次以减少原始数据错误，提供内在校对功能。
Illumina公司收购了Solexa公司的基因组分析仪后，推出了MiniSeq、NextSeq等测序平台，这些平台测序原理均是桥式PCR技术，即首先将目标DNA随机小片段化，并在小片段DNA两端进行特定的修饰形成"接头"结构。将修饰后的小片段DNA变性为单链后与测序平台上原本固定的"接头"进行锚定桥接，再向测序平台内添加未标记的dNTPs和Taq酶进行PCR扩增形成双链桥型片段，这一过程类似于将单个细菌在培养基上培养成菌落。最后再添加4种带荧光的dNTPs进行扩增，通过仪器将捕捉的光信号转化为测序峰，从而获得目标DNA片段的序列信息。
不论是基于乳液PCR技术还是桥式PCR技术的测序方法，其本质都是先将目标DNA或RNA片段碎片化，通过对小片段核酸的扩增、精准测序，并与已知的参考基因组做比对、定位和整合分析，最终通过计算机算法获得目标核酸的完整序列。
2 mNGS检测的临床应用
广泛的标本来源(血液、痰液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸水、腹水、脓液和组织标本)和对几乎所有类型感染性病原体(细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体和钩端螺旋体等)的检测能力使mNGS检测在临床感染性疾病的诊断中具有极大的潜在价值。特别是对难确诊性感染，如不明原因发热、常规临床检测反复阴性或未知病原体的鉴定方面发挥出更大的作用。
2.1 mNGS在细菌性感染中的应用
细菌是临床感染性疾病最常见的病原体之一，目前公认的细菌性病原体"金标准"的诊断方法仍是传统培养法。由于大多数细菌培养存在培养时间长、阳性率低、标本在收集过程中被污染导致假阳性等问题，无法满足临床需求，更不适用于急重症感染性疾病患者的诊治需要。同时针对临床不明原因发热患者的病原体鉴定，需要更快、更准确的检测方法。Abril等对1例难诊断的败血症休克患者的血浆进行mNGS检测，结果提示犬链球菌感染，经血培养和16S rRNA序列测定后证实了这一诊断。这是首次利用mNGS检测来诊断血浆中病原体，也是首次在重症败血症患者中使用mNGS检测进行快速诊断。Ni等对5例不明原因发热患者的血样进行mNGS检测，在其中一份血样中检测出铜绿假单胞菌。该患者后续血培养显示铜绿假单胞菌阳性，验证了mNGS检测结果。Pendleton等对1例患有结缔组织病相关间质性肺炎患者的支气管肺泡灌洗液进行mNGS检测和常规微生物检测，结果灌洗液的革兰染色仅显示中性粒细胞和"正常口腔菌群"，而mNGS检测结果为铜绿假单胞菌。随后的细菌培养结果验证了mNGS检测的诊断。这些病例显示出mNGS检测在重症感染性疾病和不明原因发热中具有重要诊断价值。
2.2 mNGS在病毒性感染中的应用
病毒性疾病的病原学诊断以免疫学检测为主，针对病毒DNA或RNA的检测方法，如PCR和基因芯片等因其高灵敏度也得到广泛应用，常作为免疫学检测阴性的补充检测方法。但PCR、基因芯片和免疫学检测一样，都是建立在已有初步临床诊断背景的前提下进行的验证性检测，无法检测出未知的病毒性病原体。由于利用mNGS检测病原体时，无需提前筛选病原体的范围，即不存在上述两类靶向测序法的偏倚性，甚至有可能发现新的病原体。Wilson等利用mNGS检测，成功诊断1例多次实验室检查及脑活组织检查未能明确的脑膜炎病例。通过对患者脑脊液和脑活检组织进行mNGS检测，发现卡奇谷病毒感染，并通过PCR和免疫组化证实脑活检组织中存在该病毒。Langelier等对22例急性呼吸系统疾病住院患者的支气管肺泡灌洗液进行了传统培养、多重PCR和mNGS检测。7个样本通过传统培养和多重PCR检测出病原微生物，其中6个确定为致病病原体。而mNGS检测在所有样本中均检测出相应微生物。此外，使用mNGS检测，在6份实验室常规检测结果为阴性的样本中发现了许多病毒，包括呼吸道病毒，如冠状病毒(HCoV-229E)、轮状病毒(HRV-A)，以及多种DNA病毒，如人类疱疹病毒(HHV-6)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、EB病毒、人乳头瘤病毒(HPV)和Torque Teno病毒。由此证明，与目前的微生物诊断技术相比，mNGS检测在病毒性病原体检测方面具有更全面的检测能力，甚至可以检测出某些未知的病毒性病原体，发现新发传染病等，因此在病毒性感染诊断中有着广阔的应用前景。
2.3 mNGS在真菌性感染中的应用
随着广谱抗菌药物和抗肿瘤药物等免疫抑制剂使用的增加，临床合并真菌感染的病例日益增加，特别是免疫力低下或长期处于免疫抑制状态，如肿瘤或HIV感染的患者。临床上真菌感染的检测主要依靠常规镜检或传统培养法，但由于检测过程繁琐、真菌培养周期长等原因，常常会延误诊断或漏诊，导致感染加重甚至危及患者生命。mNGS检测高效、快速和高准确性的特点使其成为传统真菌检测方法的有效补充。Zhou等对5份艰难梭菌阴性腹泻对照标本进行mNSG检测，结果在1份阴性对照标本中检测到大量假丝酶母菌。Li等对15例肺部感染患者的肺活检组织进行了mNGS检测，并将测序结果与传统培养法的结果进行对比，发现mNGS检测的敏感度和特异度很高，特别是在真菌检测中远远高于常规检测方法。通过与组织病理学方法对比发现，mNGS检测对真菌的检测特异度可以达到100%。这些说明mNGS检测较传统检验真菌的方法具有快速和敏感的特点，使其在真菌感染的检测中发挥出更重要的作用，特别是在一般检测难以发现的合并真菌感染的病例中会有明显的优势。
2.4 mNGS在寄生虫等其他感染中的应用
寄生虫是临床上严重威胁人类健康的常见病原体。目前，寄生虫病确诊主要依据患者体液、分泌物、排泄物的镜检或临床免疫学检查。但这些病原学检测对样本的类型、收集部位、收集时间都有严格的要求，同时检验者经验等因素对结果影响较大。mNGS检测通过大规模并行测序，有望弥补临床上对寄生虫感染检查的不足。Wilson等对7例难诊断性亚急性或慢性脑膜炎患者的脑脊液进行mNGS检测，结果显示7例患者中有1例感染猪带绦虫，1例感染HIV-1，另外4例分别感染新生隐球菌、米曲霉、荚膜组织胞浆菌和杜氏假丝酵母。这是第一次利用mNGS检测诊断出蛛网膜下腔神经囊虫病导致慢性脑膜炎的病例，展现出mNGS检测在寄生虫感染诊断中的巨大潜力。
支原体、钩端螺旋体等在临床中很难用普通方法进行培养和鉴定，特别是在免疫抑制的患者中，检测结果常为假阴性。相较传统检测方法，mNGS检测在这些病原体诊断中发挥了独特的作用。Xiao等报道了1例囊肿切开术后持续高温的病例，患者血液炎症指标提示感染，但手术部位引流液和血液细菌培养结果均为阴性。后对引流液进行mNGS检测，结果提示支原体感染，之后使用阿奇霉素治疗也有效证明了这一检测结果。Wilson等对1例表现为进展性脑积水和癫痫持续状态的严重联合免疫缺陷的患者进行mNGS检测。该患者脑组织活检、血清学检测均显示阴性结果，但mNGS检测提示钩端螺旋体感染。后来当地疾病控制和预防中心通过PCR检测证实了钩端螺旋体感染，说明当常规实验室诊断失败时，mNGS检测可以作为一种有效的补充诊断方法。
3 mNGS检测在病原体检测中的局限性及反思
只要微生物的核酸存在于临床样本中，mNGS检测就可以无差别的检测样本中常见或罕见的病原体，甚至可以发现新的病原体。在多重感染中病原体的鉴定方面，mNGS检测也比传统培养法更具优势。但其在目前临床应用中仍存在较多局限。
3.1 背景核酸干扰
由于mNGS检测利用鸟枪测序原理，因此在大多数患者样本中检测的微生物核酸是由人类宿主背景核酸构成的。由于已测序的非人类微生物核酸读数相对较少，绝大多数的读数来自人类宿主，因此限制了病原体检测的总体灵敏度。目前针对这一缺点可以通过靶向测序方法或宿主耗竭方法部分进行校正。由于16S rRNA基因定向测序能够区分大多数细菌菌种，而不会误测人类宿主背景核酸，因此mNGS检测结合靶向测序可能更适用于高度怀疑细菌感染的标本，如肺炎患者的支气管肺泡灌洗液、腹泻患者的粪便样本或脓液样本。宿主耗竭方法的目的是降低mNGS检测数据库中人类宿主背景序列的相对比例。大多数宿主背景序列通常由人类rRNA或miRNA构成，而这些人类宿主序列的缺失将间接提高非人类微生物读数的比例，从而提高病原体检测分析的灵敏度。已开发的用于宿主RNA耗竭的方法包括用于消减杂交的捕获探针，基于核糖核酸酶的耗竭方法以及对目标序列的CRISPR-Cas9切割。这些方法通常对含有大量非编码RNA序列的RNA文库是有效的，但对人类宿主DNA文库的处理效果甚微。
3.2 污染
mNGS检测过程中可能会检测出样本、试剂或实验室环境中的微生物污染物，这会使结果的分析和解释变得复杂。有时在常规的临床样本采集过程中，理论上应是无菌的部位也可能受到污染，如穿刺过程中的皮肤菌群污染或支气管肺泡灌洗过程中的口腔菌群污染。对实验室试剂的定期评估、检测设备的擦拭测试和设置阴性对照可有效避免样品的交叉污染，同时需要检测人员严格遵守试剂使用规范和工作流程前质量控制，以保持尽可能无菌和无核酸污染的检测环境。
3.3 假阴性结果
由于大部分病原体RNA极易降解，特别是检测样本在运输及保存过程中如果没有严格执行运输标准，会导致样本中原本存在的病原体RNA降解而无法检测到，产生假阴性结果。因此对样本类型的选择、运输和保存方式的优化十分重要，如外周血、脑脊液等样本须在采集后尽快进行检测，如果条件不允许则应低温冻存，使样本内病原体RNA的降解损耗降至最低，以提高检测的阳性率。
3.4 假阳性结果
利用mNGS检测对多种病原体共感染或在原发感染基础上伴继发感染的患者进行检测时，往往会得到几乎所有的病原体信息，但并非每一种病原体均是致病因素，这会导致检测的假阳性率升高。构建特征性病原体基因文库或利用多种数据库进行比对筛选或许会提高mNGS检测的准确性，同时也要求临床医师在得到mNGS检测结果后应结合其他临床检测指标、患者病史等信息综合分析，筛选出主要致病病原体进行治疗。
3.5 微生物数据库不完善
mNGS检测的结果需要与已知的微生物参考基因组数据库进行比对分析，但人类对于自然界中微生物的认知仍是冰山一角，已构建的微生物基因文库仍有许多待补充的地方。随着现代社会罕见感染病例的增多，更多未知病原体微生物的基因组信息等待人们去发现。了解和扩充微生物组数据库、寻找更具代表性和高质量的微生物基因组信息有利于更好地分析mNGS检测结果，提高检测的灵敏度和特异度。
3.6 RNA病原体检出率低
DNA病毒的基因组可以通过直接从样本中提取进行mNGS检测，而RNA病毒需先转化为互补DNA(cDNA)再进行测序。此外，与来自细菌和宿主的遗传物质相比，RNA病毒遗传物质的丰度相对较低且容易降解，因此对RNA病毒的检测率较低。在测序之前对病毒进行富集，并严格按流程标准处理标本或许可以提高RNA病毒检测的阳性率。相较于第二代测序，第三代测序即单分子即时DNA测序，可以直接进行RNA测序，降低了病原体RNA在体外逆转录后再测序产生的系统误差。
3.7 胞内菌和部分真菌检出率低
结核分枝杆菌、布鲁菌、伤寒沙门菌等兼性胞内菌主要寄居在单核细胞中，人体感染后释放到体液中的病原体含量较少，或在破壁处理后原本的病原体遗传物质受到破坏导致mNGS检测灵敏度降低。此外，mNGS对真菌等细胞壁较厚的病原微生物的核酸提取效率较低，导致病原体检出率和灵敏度较低。
3.8 缺乏有效性验证
尽管mNGS检测在感染性疾病的诊断中发挥越来越重要的作用，但传统的视触叩听、影像学评价、实验室检查，以及病理报告等仍是目前临床上诊断感染性疾病的主要方法，特别是对病原体的传统培养法仍是诊断的"金标准"。mNGS检测可以为临床医师提供更广泛的临床信息，但目前尚未在大规模临床应用中对其进行有效性验证，因此仍需结合传统检测方法对疾病进行诊断。
3.9 检测结果解读缺乏统一标准
mNGS检测出病原体并报告相应被检测出的序列数，再依据大数据库判定是否为致病病原体。通常检出序列数最多的病原体考虑系主要致病病原体，少数毒力高、致病性强但检出序列数很低的病原体会被强调为可疑致病病原体。然而不同的测序平台采用不同的数据库，再由不同的研发、临床和检验专家解读，缺乏统一标准，最终结果也会出现差异。因此仍需将mNGS检测数据和临床更好的结合，从而更准确鉴定致病病原体。
4 展望
高通量测序是一项革命性技术，其在细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体检测中具有速度快、范围广和灵敏度高的特点。尽管mNGS检测相较传统病原体检测方法有很多优势，但它并不能完全取代传统方法，两者结合可以提高临床诊断率。mNGS检测在临床应用过程中也存在诸多问题仍待解决，尤其是对测序结果中人类背景核酸的干扰需要更适当的处理以提高测序的总体分析灵敏度。
引用: 毕铭辕, 汪春付, 连建奇, 等. 宏基因组测序在感染性疾病中的应用与反思 [J] . 中华临床感染病杂志,2019,12 (5): 379-384.
2020年专家共识：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用
中枢神经系统感染性疾病的脑脊液宏基因组学第二代测序应用专家共识
好记性不如点个赞！收藏起来以防忘记哦！
小师妹和俺建立了资料分享群，邀您互相交流，微信gabstudy
点击阅读原文，进入书籍宝库，用完记得收藏哦，下次更方便。