二代测序与重症感染的病原学诊断—路漫漫且修远（杜斌）

二代测序与重症感染的病原学诊断—路漫漫且修远

引用：杜斌. 二代测序与重症感染的病原学诊断：路漫漫且修远[J]. 中华重症医学电子杂志，2022, 8（3）：193-195.

对于重症感染患者而言，早期适当的抗生素治疗是降低病死率的关键，而正确鉴别病原微生物则是恰当的抗生素治疗的前提条件。鉴别病原微生物的常规检测方法包括涂片、培养、抗原抗体检测以及核酸测定（表1）。然而，对于病原微生物的检测而言，绝大多数传统微生物学方法具有一定的目标性或指向性，即“所查即所得”。例如，临床医师怀疑患者为隐球菌脑膜炎，对脑脊液进行墨汁染色。那么，无论染色结果为何，都不会对结核性脑膜炎或病毒性脑膜炎的诊断有帮助。当怀疑患者为人免疫缺陷病毒（HIV）感染时，可检测血HIV抗体，甚至通过聚合酶链反应（PCR）进行HIV的核酸检测。然而，这一结果也无助于判定患者是否为巨细胞病毒（CMV）感染、流行性出血热或流感病毒感染。

上述事实提示，当临床医师怀疑多种病原微生物并存时，可能需要同时进行多种微生物学的检查。如果由于知识所限，临床医师没有考虑某种致病微生物的可能性，或检验科尚未建立相关的实验室检测方法（如针对肺孢子虫的PCR检测），或遇到新型冠状病毒这种新发致病微生物时，就可能造成漏诊或误诊，从而影响重症感染的治疗，甚至危及患者的生命。

近年来，二代测序（NGS）技术在某些特殊病原微生物感染诊治中的成功经验，使临床医师对其产生了浓厚兴趣。NGS作为一种无选择性的“全合一”核酸扩增方法，并不预先设置检测对象（细菌、真菌或病毒），避免了传统方法检测目标单一的缺点，临床医师也已将其作为病原学检查的常规手段用于临床诊疗，部分学术团体还制定了临床应用的专家共识。

然而，NGS技术真的已经能够常规用于感染性疾病的临床诊疗了吗？答案显然是否定的。首先，NGS技术层面缺乏标准操作流程（standard operating procedure，SOP），临床医师对于NGS的各项技术规范和细节并不熟悉。然而，对于任何一种实验室检测方法而言，阳性和阴性对照的设置都非常重要。有研究者建议，将包括CMV、HIV、无乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌、新型隐球菌、黑曲霉菌和刚地弓形虫在内的7种病原微生物作为阳性对照，而以蛋白缓冲液作为无模板阴性对照。由此可见，阳性对照的设置旨在验证检测体系是否能够准确鉴定DNA病毒、RNA病毒、革兰氏阳性球菌（厌氧）、革兰氏阴性杆菌、酵母菌、霉菌和寄生虫等各种病原微生物。相比之下，目前很多NGS检测采用了不同的阳性和阴性对照，甚至部分都没有设置阳性和阴性对照。

其次，NGS结果的解读缺乏统一的判定标准。目前，部分NGS检测仅报告核酸序列数的绝对值。然而，假设两个标本的测序结果非人源序列数分别为10兆和100兆，即使两个标本的大肠埃希菌序列数均为100兆，根据非人源序列数进行校正后其结果也将相差10倍，即使阴性对照标本中也能够检测到2405种微生物的基因序列。因此，部分专家建议将微生物序列数根据标本中非人源核酸序列数以及阴性对照结果进行校正。那么，究竟应当根据哪个指标进行结果的判定？而且，对于脑脊液等（宿主基因含量很少）无菌标本，NGS结果的判定标准是否与血液或下呼吸道标本（宿主基因组含量大）有所不同？从病原微生物的角度出发，病毒和真菌的判定标准是否应当与细菌有所不同？进一步讲，即使我们判定NGS为阳性结果，那么检出的核酸片段能否提示该微生物是存活的（具有繁殖或致病能力）？能否判定该微生物是致病微生物而非单纯定植？在上述问题尚未得到深入研究并得到满意答复前，NGS用于临床常规诊疗显然过于匆忙和草率。

第三，NGS对某些感染的诊治缺乏指导意义。有限的临床研究表明，NGS诊断侵袭性肺曲霉菌感染的敏感度仅为45.5%，可能的原因包括真菌感染时微生物负荷较低，同时真菌细胞壁较厚，影响核酸提取效率。即使NGS对细菌感染的诊断准确性与培养相当，但是，细菌耐药谱的确定仍需等待常规培养和药敏试验的结果。尽管部分NGS平台可以同时检测耐药基因，但临床意义尚有待观察。事实上，与全基因组测序不同，NGS对于微生物基因组的覆盖率并不高，因此对于小片段耐药基因的检测很可能遗漏。另外，即使NGS系统能够检测多种耐药基因，但对抗生素治疗的指导作用可能有限。例如，当NGS同时报告检测到金黄色葡萄球菌及mecA基因时，临床几乎可以肯定该细菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），应选择糖肽类或唑烷酮抗生素进行治疗。类似的例子还包括肠球菌属与vanA基因、肺炎克雷伯杆菌与CTX-M-2基因等。这是因为上述细菌、耐药基因和抗生素药敏结果之间呈现一一对应的关系。然而，这种对应关系在临床上毕竟属于少数。比如，若同时检测到肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌和CTX-M-2基因，那么，究竟是哪个细菌携带了耐药基因？如果判断铜绿假单胞菌同时携带ampC、mexAB和/或ompF基因，那么对应的抗菌谱如何？哪种抗生素仍然保持敏感性？上述难题有待技术进步与人工智能的引入才有可能得到（部分）答案。

第四，NGS的理论优势并未得到临床研究的验证。从理论上讲，NGS诊断感染的敏感度很高，但特异度差，因而具有很高的阴性预期值。换言之，如果NGS结果阴性，则临床医师应当能够比较可靠地排除感染诊断。然而，研究发现，在58例中枢神经系统感染患者中，临床与NGS共同诊断者19例，NGS诊断者仅13例，另有26例仅通过临床诊断，提示NGS的敏感度仅为55%。

最后，医学技术的进步固然值得期待，但临床医师还是应当注重临床知识与技能的培养。例如，肺炎克雷伯杆菌是东亚地区社区获得性肺炎合并肝脓肿的最常见致病菌，且基本上对所有抗生素敏感，这理应是最基本的临床知识。然而，将NGS当作“傻瓜书”，不加选择地用于所有怀疑感染的患者，最终是否会导致临床医师能力和水平的下降，而只会单纯依靠高科技的检查？

总之，作为一种新的实验室诊断技术，NGS为感染性疾病的病原学诊断带来的一次革命。然而，现有证据尚不足以支持这种新技术在临床上的常规应用。

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