外泌体参与脓毒症发生发展及临床诊治方面的研究进展
外泌体参与脓毒症发生发展及临床诊治方面的研究进展
脓毒症是危重症患者死亡的主要病因。一项亚洲地区脓毒症流行病学调查研究显示，重症监护病房（ICU）中脓毒症总体发病率为22.4%，在低收入国家以及中低收入国家中脓毒症总体住院病死率为32.6%[1]。早期脓毒症被定义为由感染引发的全身炎症反应，随着对其病理机制的深入研究，脓毒症被定义为宿主对感染的免疫反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍，具有病理机制复杂、高异质性等特点[2，3]。近年来，聚焦外周血炎症因子、代谢图谱及转录组、蛋白质组图谱特征，开发了脓毒症分子分型、早期诊断、治疗效果及预后评估模型，推进了脓毒症分子标志物及病理机制研究的深入发展，但也存在特异性欠佳、临床应用转化难度大等局限性。外泌体是一类由多种类型细胞分泌产生的直径约为30～150 nm的膜囊泡，参与脓毒症器官功能障碍及多种病理生理调节过程[4，5]。本文聚焦外泌体新型检测技术方法，以及外泌体在脓毒症病理发展、早期诊断、危重度分层、治疗及预后评估的最新研究进展进行综述，以期为脓毒症诊疗提供新思路。
1 外泌体的最新认识
1983年，Pan和Johnstone[6]在成熟的绵羊红细胞中发现小囊泡样物质，被视为"细胞废物"。20世纪90年代，细胞外囊泡被重新定义为细胞间信息交流的新形式，可分为外泌体、凋亡小体、外胚层小体、胞外小体、微囊泡和微颗粒等[5]；其中，外泌体是一种被广泛研究的细胞外囊泡。外泌体包含蛋白质、脂质、脱氧核糖核酸（DNA）以及核糖核酸（RNA）等多种物质，在细胞间信息交流中发挥重要作用[7]。
外泌体广泛存在于血液、尿液、脑脊液等体液中，作为一类重要的生物信息传递载体，参与肿瘤、衰老等病理过程。体液中外泌体生物学特征具有特异性，与疾病发生发展紧密相关，逐步被开发为重要的生物标志物[8]。基于外泌体的纳米特征、非免疫原性、物质承载性及靶向性特点，其被用于载药体系构建和免疫治疗等精准医学领域[9，10，11]。
2 外泌体新型检测方法
外泌体体积微小且富含活性物质，建立有效的分离方法是分析其特征和临床应用转化的重要前提。目前，外泌体分离方法分为三类：基于颗粒特征的非标记计数法；基于分子特征的标记法；整合颗粒以及分子特征的全自动外泌体分析仪（Exocounter）[12]。超速离心法和超滤法均为非标记法，也是早期外泌体分离常用方法，但存在所需设备昂贵、耗时较长、特异性低、生物活性损伤等局限性。近年来，随着免疫亲和标记技术的发展，外泌体新型检测方法不断发展，推进血液、尿液、脑脊液等体液液体活检技术的临床应用。
2.1 流式细胞术（flow cytometry，FCM）：
外泌体体积小且具有异质性，常规流式细胞不能用于外泌体分析。通过安装pH响应性二酰脂耦联聚合物（diacyl lipid-conjugated polymer，DLP），使外泌体在中性缓冲液（pH 7.4）中随DLP的去质子化而疏水成簇，待簇大小（≥1 μm）大于FCM可检测尺寸限制时，即可使用FCM对外泌体进行直接分析[13]。范泽华等[14]通过加入肠上皮细胞黏附分子的抗体，使用FCM对肠淋巴液外泌体的来源以及数量进行检测，创建了肠淋巴液外泌体相关提取技术。基于磁珠及特殊抗体的外泌体分析FCM有其他评估方法所不具有的特异度和敏感度，可能成为临床上一种标准分析方法。
2.2 核磁共振波谱法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMRS）：
NMRS检测体积微小的外泌体不需要生物或化学修饰，可实时确定外泌体体内动力学，具有无创、无辐射暴露的特点。Ullah等[15]用扩散有序波谱（diffusion ordered spectroscop Y，DOSY）核磁共振方法，通过顺序超速离心法和体积排阻色谱法（size exclusion chromatography，SEC）等过程对牛奶以及胚胎肾癌和肾癌细胞分泌的外泌体进行提取后，根据外泌体的粒径分布特性进行1H DOSY NMRS分析发现，其可以检测出1～500 nm外泌体的细胞外纳米颗粒。
2.3 纳米颗粒微流体法：
微流体技术是指在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的技术，操作效率高，可自动化实施降低交叉污染风险。Ayala-Mar等[16]设计了一种基于直流绝缘体的介电泳方法，即将两根电绝缘柱嵌入微通道中，利用电极之间产生介电泳力作用于溶液中外泌体，实现外泌体捕获及亚群分析，具有高通量、快速、稳定和微量分析的优势。此外，适配体（Aptamer）是一类寡核苷酸序列或短肽，可与相应配体进行高亲和力及强特异性结合。Zhou等[17]利用微流体系统结合CD63和PTK7特异性适配体的方法，无需样本预处理便可在20 min中实现107～108粒/mL外泌体的快速分离。
2.4 纳米等离子系统法（intravesicularnano plasmonic system，iNPS）：
利用等离子体芯片捕获外泌体裂解物中的分子靶标，再结合纳米颗粒标记进行信号放大，可高敏感度、高通量地实现外泌体携带的膜蛋白、胞质蛋白表达检测[18]。微流体技术与iNPS结合，使用低成本阳极氧化铝薄膜可制备金纳米椭球阵列，在其表面修饰外泌体CD63特异性抗体，与微流控芯片集成，可实现多参数检测；改变金纳米椭球体表面抗体可普遍适用于其他生物标志物的检测[19]。
2.5 全自动外泌体分析方法：
全自动外泌体分析基于特异性免疫捕获技术，以温和的方法捕获外泌体全方位特征信息，包括粒径大小、计数、分布特征、携带蛋白、生物标志物（CD9、CD81、CD63等）共定位等[12]。Kabe等[20]在实验中通过涂有特殊抗体的光盘捕获单个外泌体，并用抗体耦联的磁性纳米珠进行标记，可检测出细胞培养基和人血清中的外泌体数量及特征；并基于此技术发明了全自动外泌体分析仪。Yokose等[21]联合使用凝集素芯片和全自动外泌体分析方法发现，胰腺癌患者血清中存在O-多糖修饰的外泌体含量升高，其是胰腺癌早期诊断生物标志物；该研究证实全自动外泌体分析方法分析外泌体绝对定量比传统酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）或FCM具有更高敏感度和高线性特点。全自动外泌体分析方法允许研究者直接分析生物样本中外泌体，无需经过复杂的预处理，为液体活检分泌外泌体特征带来新的技术方案。
外泌体分离、纯化是其生物学特征分析和临床应用的关键步骤，各种方法有优势，也有局限性（表1），具体取决于特定应用所需的外泌体分离规模、纯度和易用性。
3 外泌体参与脓毒症病理进展
外泌体作为细胞间信息传递的重要载体，其中包含的蛋白质、代谢小分子、DNA和RNA等物质在脓毒症发生发展中发挥重要调节作用；其与脓毒症免疫炎症反应失调、氧化应激、凝血功能障碍及多种途径密切相关。
3.1 免疫炎症反应失调：
脓毒症的突出病理特征之一是免疫反应失调，主要表现为促炎和抗炎细胞因子异常分泌。脓毒性休克患者入ICU 24 h内和治疗7 d时的外周血外泌体主要来源于血小板，富含多个差异性微小RNA（microRNA，miRNA），与免疫炎症反应指标白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、核转录因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和Toll样受体信号通路有关，也参与树突状细胞（dendritic cell，DC）成熟过程[22]。在另一项探讨脓毒症相关急性肾损伤（sepsis-induced acute kidney injury，SAKI）的研究中，金翠等[23]发现骨髓间充质干细胞来源外泌体（exosomes derived from bone mesenchymal stem cell，BMSC-Exo）对脂多糖诱导的HK-2细胞活性下降以及细胞炎症反应均有一定的保护作用。黄俊鸿等[24]对超速离心法提取的脓毒症患者以及健康者血浆外泌体分析发现，脓毒症患者循环外泌体含量明显高于健康者，且使用血浆外泌体干预T细胞后其早期活化指标以及T细胞中程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）表达上调，调节性T细胞比例增加。以上研究提示脓毒症发生发展中各种免疫细胞分泌外泌体是介导免疫炎症反应的重要病理机制，但仍需深入研究。
3.2 氧化应激：
氧化应激是脓毒症重要病理机制之一，抗氧化治疗是脓毒症有效治疗方法[25]。脓毒性休克患者外周血中外泌体包含差异性mRNA和miRNA，多与炎症反应以及氧自由基代谢有关[22]。Janiszewski等[26]研究发现，血小板来源外泌体中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化活性可以引起血管氧化应激反应，与血管内皮细胞凋亡有关。诸多研究显示，间充质干细胞、巨噬细胞、脂肪来源干细胞、内皮祖细胞均可以分泌外泌体，富含miRNA、环状RNA（circular RNA，circRNA）等，经转录因子E2相关因子2-血红素氧合酶1（nuclear factor E2-related factor 2-hemeoxygenase-1，Nrf2-HO-1）、MG53（一种E3泛素连接酶）、RUNX家族转录因子1（RUNX family transcription factor 1，RUNX1）等途径影响氧化应激、线粒体损伤等过程，参与脓毒症器官损伤[27，28]。
3.3 凝血功能障碍：
弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）是脓毒症的严重并发症。脓毒症相关DIC患者中性粒细胞来源外泌体含中性粒细胞DNA、组蛋白、核小体和其他损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP），有促凝作用[29，30]。血小板经脂多糖刺激产生外泌体或脓毒性休克患者外泌体含高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）、miR-15b-5p和miR-378a-3p，可以通过自噬途径促进中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap，NET）形成，是脓毒症及相关器官损伤的主要因素[31]。外泌体作为信号载体参与促凝、NET形成以及脓毒症相关DIC，是脓毒症新进关注的病理调控机制；其携带的分子信号除了诱导凝血功能障碍之外，也为靶向改善脓毒症相关DIC提供了新的研究视角。
3.4 多组学数据分析揭示脓毒症患者血清外泌体生物学特征：
通过对比分析3位健康者和9例脓毒症患者外周血清外泌体的多组学数据特征发现，外泌体存在354种蛋白，195种mRNA，82种长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和55种miRNA差异性表达；其功能途径涉及"细胞因子风暴"、补体凝血级联反应、内皮屏障和维生素代谢等过程；其中，外泌体携带IL-10可能是SAKI的重要原因[32]。脓毒症发病机制复杂，极具异质性，多组学数据为外泌体生物学特征解读提供了技术手段，但后续实验性验证分析仍十分必要。
4 外泌体在脓毒症中的临床应用
外泌体作为机体多细胞可分泌的一类体液内信号分子载体，其包含的多种生物学小分子成为脓毒症早期诊断、病情评估、治疗效果评价的生物标志物备受重视。
4.1 外泌体在脓毒症诊断、评估中的应用：
Im等[33]利用ELISA分离脓毒症患者血浆外泌体，其总体水平与脓毒症严重程度（脓毒症：204 mg/L，严重脓毒症：525 mg/L，脓毒性休克802 mg/L，P<0.01）及序贯器官衰竭评分（sequential organ failure assessment，SOFA）呈正相关，高水平外泌体与患者28 d、90 d病死率增加有关，可作脓毒症预后生物标志物。此外，施芬和罗汉清[34]通过对比分析脓毒症患儿与健康儿童外周静脉血外泌体中lncRNA HOXA11-AS的表达情况，发现脓毒症患儿外泌体中lncRNA HOXA11-AS表达水平显著高于健康儿童，并且与患儿白细胞水平和C-反应蛋白水平呈正相关，具有一定的筛查诊断价值。外泌体内含生物小分子种类繁多，作为脓毒症生物标志物的敏感度、特异度均有待在大样本临床研究中加以验证，以利于实现临床应用转化可能。
4.2 外泌体在脓毒症治疗中的作用：
外泌体在脓毒症干预和治疗方面的应用尚处于实验阶段，多以动物实验研究为主。脂肪来源干细胞外泌体可以减轻脂多糖诱导的活性氧积累，降低炎症细胞因子水平，减轻脓毒症多器官损伤[35]；徐莹等[36]通过盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture，CLP）诱导大鼠SAKI模型，通过对比存活率、肾功能水平以及血液炎症指标等发现，脐带间充质干细胞来源外泌体通过改善肾功能、炎症水平以及细胞增殖水平等方面对SAKI有一定的保护作用。Li等[37]发现，当肿瘤患者合并脓毒症时，其生存率更高；进一步研究发现，肿瘤细胞分泌外泌体富含的7种关键miRNA可有效降低小鼠和猕猴发生脓毒症的概率，可能与肿瘤细胞分泌外泌体抑制脓毒症高炎症反应有关，有望成为脓毒症的新型治疗方式。
5 总结与展望
根据外泌体的不同特点，不断涌现出更加精准、便捷的新型检测技术。在脓毒症发生进展过程中，外泌体参与免疫炎症反应、氧化应激以及凝血功能障碍等多个病理生理过程，具有重要研究价值。同时，外泌体携带生物分子是脓毒症及其相关器官功能障碍的生物标志物和重要信号调节分子，为脓毒症病理机制研究和干预措施开发带来全新的研究视角。目前，应用外泌体新型检测技术帮助脓毒症诊疗的相关研究仍然较少，对外泌体精准分离、活性检测、验证分析及临床应用转化仍需进一步深入探索和研究。
引用: 赵奕琳, 刘田恬, 王春霞. 外泌体参与脓毒症发生发展及临床诊治方面的研究进展 [J] . 中华危重病急救医学, 2024, 36(2) : 221-224.