CAR-T技术历经三生三世十里轮回，韩教授团队详细描述如何控制CAR-T细胞活性
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撰文丨板栗
责编丨刀刀
正如我们所了解的，CAR-T是最近几年中肿瘤治疗领域最吸引人眼球的技术之一。因为其在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，所以被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
一项伟大的技术往往都要历经三生三世十里轮回，CAR-T也不例外，JUNO的临床死亡和部分患者治疗后复发让CAR-T技术的轮回充满故事性。
大部分人都一致认为，CAR-T的江湖并非风平浪静，前方仍有强大的挑战：
1、抗原缺失复发—主要在抗CD19的CAR-T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞白血病中观察到，是对CAR-T细胞治疗的新威胁
2、通过CAR-T细胞识别健康组织导致ontarget/off-tumor的毒性可以引起严重的不良反应甚至危及生命，特别是在实体瘤的环境中。
3、实体瘤中的疗效较低—主要是由于肿瘤微环境的影响
4、单个自体细胞制备的局限性很难实现细胞治疗的工业化制备
CAR-T的研发者正在如何克服这些挑战，未来的技术发展又会走向何方？
上次我们的介绍：
韩为东教授团队J Hematol Oncol杂志发表最新CAR-T权威综述：新的CAR-T设计如何提高实体瘤治疗的安全性
韩为东教授团队已经论述了CAR-T细胞治疗优化的主要方向，包括克服抗原缺失复发、增强其有效性和安全性。
这篇综述具体从以下4个方面分析了CAR-T细胞治疗的未来方向
1、如何克服血液恶性肿瘤中的抗原丢失复发
2、如何提高实体瘤中CAR-T细胞的安全性
3、提高CAR的选择性
4、控制CAR-T细胞活性
前三个方面我们已经重点描述，今天板栗和大家重点探讨一下 如何控制CAR-T细胞活性。
从近几年的相关研究来看，有多种途径可以控制CAR-T细胞活性：
限制CAR的表达
可切换的CAR
自杀基因
限制CAR的表达
目前，病毒技术是用于临床工作的最常见的基因转移策略，例如逆转录病毒或慢病毒可导致永久性转基因编码CAR表达；然而，当与CAR-T细胞治疗相关的严重毒性发生时，这些都是不利的情况。以瞬时CAR基因表达为特征的CAR mRNA电穿孔的非病毒方式，这种将新型CAR引入到患者体内相比较于病毒技术被认为是更安全的。
宾夕法尼亚大学的研究者根据临床前研究的令人鼓舞的结果首先评估了靶向间皮素（MSLN）表达实体瘤患者中的MSLN-specific mRNA CAR-T细胞，并证明了这种新策略的可行性和安全性。加上观察到的抗肿瘤活性，这支持了基于mRNA CAR的实体肿瘤的发展。
慢病毒载体、非病毒转座子载体，直接mRNA电穿孔是主要的载体/转染方式：反转录病毒只能感染正在复制的细胞，效率较低；慢病毒是反转录病毒中唯一能感染非复制状态的一类，效率提高。病毒载体往往只能一次使用，人体会对病毒蛋白产生抗体，第二次遇到时失效；转座子和裸DNA载体价格便宜，较为简单，但是效率需要提升；mRNA电穿孔进入只是暂时表达，安全性提升，但是无法持续表达。
值得注意的是，由于转基因的瞬时表达，多次输注对于mRNA CAR-T细胞是必需的，如所报道的，这将会增强过敏反应的风险。总之，基于靶向间皮素(MSLN-specific) mRNA CAR T细胞中显示的安全性特征，在随后的临床试验中设计并测试使用慢病毒转导的抗MSLN CAR-T细胞。
最新研究显示了局部给予靶向间皮素(MSLN-specific)
CAR -T细胞在临床胸膜间皮瘤相关模型中的治疗优势。MSLN是肿瘤相关的细胞表面抗原，选择该抗原是由于其在一系列癌症中过表达，并且过表达与间皮瘤、肺癌和乳腺癌患者的肿瘤发展相关。局部给予靶向MSLN的CAR-T细胞可建立长期的系统性免疫监视，所用剂量低于静脉给药30倍。考虑到T细胞在实体瘤中可能导致低浸润，在以极低剂量给药时需要检查CAR-T细胞的效果。
可切换的CAR
为了更好控制CAR-T细胞在体内的活性来对其不良反应作出调整，现在很多研究放在了为CAR加上一个开关。将整个CAR载体置于能操控的开关系统下，用相应的小分子药物对其进行消除，有效的对整个CAR系统进行开启或关闭。
可切换的CAR是一种结合分子开关的新型设计，通过二聚化小分子或肿瘤靶向抗体使接CAR结构的两个相邻结构域或肿瘤抗原和CAR-T细胞相连，通过这些CAR-T细胞的抗肿瘤活性严格依赖于那些开关分子存在下的受体复合物形成，开放了远程控制或终止CAR-T细胞应答的机会以避免输注T细胞后可能立即发生的off-target毒性。
研究团队展示了可切换的CAR设计，其中单独的细胞外抗原结合结构域和细胞内信号组件可以通过仅在单分子成像证实的异二聚化小分子（雷帕霉素类似物AP21967）的存在下诱导FKBP和FRB的结合。
实验过程中，他们还观察到通过可转换的CAR-T细胞在体外和体内有效杀死靶细胞，并且以可滴定的方式调节该应答。通过使用直接整合到将scFv与细胞膜分开的铰链结构域的系统，在另一种可转换的CAR中观察到类似的结果。
加利福尼亚生物医学研究所的一个小组开发了基于抗体的开关，他们是将异硫氰酸荧光素（FITC）或抗多肽新抗原表位（PNE）特异性引入肿瘤抗原特异性抗体，其可以重定向CAR-T细胞特异性针对相应的FITC或PNE与表达相同肿瘤抗原的肿瘤细胞形成开关依赖性免疫突触。这些双开关系统介导的CAR-T免疫突触的形成方式，是一种可以自定义的和可控的行为。
他们通过靶向CD19，CD22和HER2在B细胞恶性肿瘤和乳腺肿瘤中测试了该方法，并且证明这些可转换的CAR-T细胞具有有效的抗原特异性和剂量依赖性的抗肿瘤活性，为改善CAR-T细胞治疗在临床上的安全性提供了一个具有吸引力的方式，表明了这些可切换的CAR-T细胞可以适用于广泛的肿瘤抗原。
自杀基因
与上述的将整个CAR载体置于能操控的开关系统下，用相应的小分子药物对其进行消除，有效的对整个CAR系统进行开启或关闭的方式不同，结合自杀基因，激活其诱导CAR-T细胞的死亡的方式是不可逆的。
自杀基因已有多种，可诱导的Caspase9转基因（iCasp9）是目前较理想的自杀基因，它无免疫原性且能在24h内引起95 %以上的转基因细胞快速凋亡。iCasp9介导的细胞凋亡可由小分子二聚体AP1903触发，具有很强的可操作性。
Di Stasi 等人首先在同种异体造血干细胞移植（HSCT）受试者中测试了iCasp9修饰的供体T细胞，在给予4个移植物抗宿主病（GVHD）患者单剂量AP1903之后30分钟内显示超过90％的修饰的T细胞被消耗。
这种快速的起效导致GVHD在24小时内永久性消除，尽管仍然存在少量残留的iCasp9修饰的T细胞。目前，评估iCasp9修饰的CAR-T细胞的几个临床试验正在招募患者；然而，这些残留细胞群和iCasp9引起二聚化的可能性潜在地限制了该策略的广泛使用。
当转导的细胞被工程化以表达抗体靶向的细胞表面抗原如tEGFR时，这种选择性耗尽也可以由临床批准的治疗性抗体介导，在细胞外结构域III中保留完整的西妥昔单抗结合位点的人类表皮生长因子受体（EGFR）多肽。
此外，tEGFR可以作为细胞表面标志物用于体内输注的CAR-T细胞的鉴定，并已被用于临床试验。然而，在发生严重毒性的情况下，这种通过抗体依赖性细胞毒性的细胞凋亡是否可以迅速开始，仍未确定，并且需要在即将到来的临床试验中验证。
许多研究人员正在积极开发CAR-T疗法，以期在其它血液学恶性肿瘤和实体瘤中取得成功结果。这一过程面临的挑战包括，靶抗原的选择、毒性的管理以及免疫抑制肿瘤微环境的调节。这一综述希望最终能够为开发更安全、更有效的CAR-T疗法提供指导。
参考文献：
J Hematol Oncol. 2017; 10: 53.
Published online 2017 Feb21. doi: 10.1186/s13045-017-0423-1
CAR-T临床试验回顾：
西比曼集团联合江苏省人民医院启动CAR-T治疗难治性DLBCL临床试验
纪念斯隆凯特林癌症中心CAR-T临床应用：超级CAR对抗实体瘤
最新：Cellectis第二例通用型CAR-T临床结果公布（外加仿制药的晴天霹雳）
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