Nature子刊：新型细胞因子系统助力CAR-T疗法攻克实体瘤，特异性和安全性优势显著丨医麦猛爆料
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2020年2月4日/医麦客新闻 eMedClub News/--嵌合抗原受体(CAR)T细胞在恶性血液肿瘤中展现出的强大实力，使其成为近年来最有前景的肿瘤免疫疗法。迄今为止，全球范围内已有两种靶向CD19的CAR-T疗法成功上市，用于治疗某些B细胞恶性肿瘤。
随着2019年12月，吉利德(Gilead)旗下Kite Pharma和百时美施贵宝(BMS)先后像美国FDA提交各自CAR-T产品的生物制剂许可申请(BLA)，我们即将迎来第二批进入市场的CAR-T细胞产品。
2019年12月11日，Kite宣布已经向FDA提交了该公司第二款自体CD19 CAR-T疗法KTE-X19的生物制剂许可申请(BLA)，用于治疗复发/难治性套细胞淋巴瘤(MCL)患者。这使得KTE-X19有望成为首款治疗MCL的CAR-T疗法。
12月18日，百时美施贵宝(BMS)的一款将CD4+和CD8+ CAR-T细胞1:1比例回输的自体CD19 CAR-T疗法(liso-cel, 以前称为JCAR017)也向美国FDA递交了的BLA，用于治疗既往至少2种方案系统治疗失败的复发/难治性大B细胞淋巴瘤(LBCL)成人患者。
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2019年7月，科济生物BCMA-CAR-T也宣布在中国美国加拿大都已经获批临床。
但无一例外的是，这些待上市的产品依然还是针对的血液肿瘤。作为细胞疗法的主力军，CAR-T细胞疗法在当下全球范围内1011款已获批或正在研发的细胞疗法中占比超过了五成，共有568款，超过了剩余疗法（譬如TCR-T细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法等）类型的总和。其中CD19仍然是最受欢迎的靶点，共有142款细胞疗法针对的是这一靶点，其中有130款CAR-T疗法。
▲2018至2019年全球用于癌症的细胞疗法管线（图片来源：参考出处2）
而事实上，根据2019年最新的全球癌症数据，全球范围内大约90%的癌症病例为实体肿瘤，但关于实体瘤的细胞治疗临床试验却很少。2019年发表在Nature Reviews Drug Discovery的一篇综述的数据就显示，自1993年开始的所有细胞治疗试验中，只有一半是针对实体瘤，并且大部分集中于黑色素瘤、中枢神经系统肿瘤、以及肝癌上，而发病率较高的前列腺癌、乳腺癌、肺癌等都相对较少。许多实体瘤类型没有进行任何专门的细胞治疗试验。
▲实体瘤和血液肿瘤的细胞治疗试验比较（图片来源：参考出处2）
虽然目前CAR-T细胞的临床试验中占主角的也仍然是血液肿瘤，并且CAR-T在血液学环境中的成功尚未转化为实体肿瘤环境中的显著水平的客观临床反应；但在活跃的临床前细胞疗法中，242个是专门针对实体肿瘤设计的，而172种是针对血液肿瘤设计的，这表明细胞治疗领域对实体肿瘤的兴趣日益浓厚。
▲细胞疗法在血液肿瘤和实体瘤中的临床分期比较（图片来源：参考出处2）
一直以来，与血液肿瘤相比，实体瘤的抗原异质性，免疫抑制性微环境，以及厚实的细胞外基质等让细胞疗法难以有效发挥，因此成为细胞疗法治疗癌症的主战场。CAR-T疗法作为一种极具潜力和应用价值的癌症治疗策略，科学家们试图通过它来攻克实体瘤的探索从未停止。
2月3日，Nature Biotechnology上发表了一篇研究性文章，描述了应用于CAR-T的一种新型的细胞因子系统p40/IL23，他们发现IL23细胞因子可以特异性地作用于激活状态下的CAR-T细胞并提高其在识别肿瘤抗原后的增殖以及在多个固体肿瘤模型中抗癌功能；相比于之前利用IL2或者IL15提高CAR-T细胞增殖的研究，该细胞因子系统在抗癌功能、特异性和安全性上具有独特的优势。这项研究来自美国北卡罗莱纳大学教堂山分校（University of North Carolina at Chapel Hill）的Gianpietro Dotti教授和其博后许扬团队，目前已经在美国申请了专利并会在不久的将来进入临床测试阶段。
CAR-T在实体瘤中的效果普遍不佳，其中主要原因之一是由于肿瘤微环境对T细胞增殖和效应功能的抑制。目前热门的研究方向普遍专注于对T细胞进行进一步的修饰从而提升CAR-T细胞在实体瘤中的增殖和效应功能。
过去的研究也发现，利用促生长细胞因子，比如IL2或者IL15可以显著的提升CAR-T细胞在肿瘤中的增殖从而延长其能在体内的存活和抗癌功能。但是，IL-2和IL-15信号亦可以激活体内其他的免疫细胞，比如NK细胞和记忆T细胞，导致系统性炎症反应，比如毛细血管渗漏综合症。因此，将促生长信号选择性地作用于CAR-T细胞成了领域内的难题之一。
IL23是一个异源二聚体的细胞因子，由IL-23α p19 和 IL12β p40 两个亚基组成，已知可促进记忆T细胞和T辅助型17细胞（Th17细胞）的增殖。IL23属于IL-12细胞因子家族，在炎症反应，尤其是Th17细胞诱导的自身免疫疾病中发挥重要作用。IL23一般由活化的巨噬细胞或者树状细胞产生并作用于表达IL23受体的Th17细胞促进其增殖和稳定性。而在这篇文章中，研究者发现了IL23独立于Th17细胞的功能并利用其特性开发出应用于CAR-T细胞的细胞因子。
首先，研究者发现IL23受体（IL23R）选择性地表达于激活的人源记忆T细胞上，而在未激活的T细胞中并无显著表达。加入重组IL23蛋白后可以显著提升激活后T细胞的增殖能力而对未激活的T细胞并无明显的作用。同时，研究者排除了IL23对活化记忆细胞的促生长功能是源于其诱导Th17分化或增殖的可能性。
为了利用IL23在激活中T细胞的特异性功能，研究者试图让CAR-T细胞自身过表达IL23从而使其可以在被肿瘤激活后接收到IL23的生长信号。在这个过程中，研究者意外地发现，在T细胞抗原受体(TCR)刺激下，T细胞上调IL-23受体和IL-23α p19亚基，而另一个亚基IL12b p40并不在T细胞中表达。因此研究人员设计p40亚基在T细胞中表达(p40- Td细胞)，活化T细胞中表达的p19亚基结合转入的p40亚基，产生并分泌完整的IL23蛋白；从而活化的T细胞通过自分泌IL-23信号获得选择性增殖活性。
在这里，由于未活化的T细胞因为缺少p19并不会分泌IL23蛋白，因此研究者结合了细胞自身对IL23受体和p19亚基的调控机制和p40基因修饰，使得IL23的分泌和作用范围限制在激活后的T细胞，极大的减少了细胞因子系统性释放和作用的风险。
将这一策略用于CAR-T细胞，p40导入人源CAR-T细胞中，识别肿瘤细胞后激活的p40-Td CAR-T细胞会诱导性地分泌IL23。与一般CAR-T细胞相比，p40-Td CAR-T细胞细胞增殖能力和体外抗肿瘤能力增强，颗粒酶B增加，PD-1表达降低。在两种异种人源实体肿瘤小鼠模型中（神经母细胞瘤和胰腺癌），与表达IL-18或IL-15的CAR T细胞相比，p40-Td CAR T细胞表现出更佳的抗癌疗效和更弱的副作用，显示出极大的临床潜力。
另外，研究人员还通过动物实验验证了p40修饰和分泌的IL23的安全性。研究者将鼠源p40蛋白导于OT1 T细胞中，治疗OVA过表达黑色素瘤B16模型。p40导入的OT1 T细胞可以更好的控制黑色素瘤的生长，同时小鼠组织分析结果显示，只在肿瘤中检测到了T细胞产生的IL23的蛋白，而在血清中无法检测到IL23。在血液，脾脏，淋巴结中的免疫细胞指标，p40组和对照组都几乎一致，而在肿瘤中，p40显著提升了过继转入的OT1 T细胞的数量。
最后，研究者通过一系列体外实验，发现因导入p40而产生的IL23蛋白会优先结合产生IL23的T细胞，而在附近同样处于激活状态并表达IL23R的细胞上并不会有显著的结合。这一系列实验证明了IL23在体内作用的位置和细胞上的特异性，进一步保证了其安全性。
CAR-T治疗实体瘤的其他突破与进展
CAR-T细胞疗法作为细胞疗法的主力军，克实体瘤的脚步从未停止过。截至2019年5月，在ClinicalTrials.gov注册的大约总共510个CAR-T临床试验中，160个已完成或正在进行的CAR-T临床试验针对实体瘤，其中64％在I期，30％在I/II期，3%在II期，2%是长期随访，1%是回顾性研究。国内，科济生物医药的靶向GPC3的CAR-T细胞产品于去年年初（2019年1月24日）获得CDE批准临床试验，这是我国首个用于治疗实体瘤的CAR-T细胞药物。
▲ 针对实体瘤的CAR-T临床试验 (按靶点和阶段)（图片来源：BioDrugs）
分泌型CAR-T
这是基于Wayne Marasco博士实验室开发出的一种专有策略，通过使用双特异性CAR系统来限制脱靶(on-target/off-tumor)毒性，该系统中的两个单链可变片段(scFv)被连接起来，以驱动细胞内足以激活/杀死T细胞的信号。只有当两个靶标同时作用于肿瘤时，才会触发这种激活/杀伤。这种设计有望大大降低CAR-T细胞介导不可控的免疫副作用，从而提高安全性。
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类似地，Eureka Therapeutics (优瑞科公司)和MSKCC(纪念斯隆凯特琳癌症中心)团队也在设计一种分泌免疫调节抗体的CAR-T细胞。这种CAR-T细胞分泌迷你版本的PD-1检查点阻断抗体(ScFvs are smaller)，在体内的持续时间均比传统CAR更长，同时，还产生了更好的治疗结果。
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对抗T细胞衰竭
神奇金属薄膜，送CAR-T细胞直达实体瘤
已知对于实体肿瘤，经静脉注射的CAR-T细胞不仅难以进入肿瘤并以战胜癌症所需的数量与肿瘤结合，也难以在肿瘤病灶形成的不利微环境中生存。2019年12月9日，Fred Hutchinson（弗雷德哈钦森） 癌症研究中心的Matthias Stephan团队在 Nature Biomedical Engineering 杂志上发表了一项研究，他们成功研制了一种可以将CAR-T细胞直接“空降”至肿瘤组织周围的金属网膜。
他们选择用于修复骨折、矫正牙齿和防止动脉阻塞的金属——镍钛，制成了厚度为10微米，具有类似迷宫自上而下视图的直线图案结构的金属薄膜。研究人员在镍钛薄膜上涂上了纤维蛋白和刺激分子（CD3、CD28和CD137）。该纤维蛋白是一种存在于血液中的纤维蛋白，为T细胞提供爬行需要的“手柄”，刺激分子则模拟T细胞接收的信号，使其快速扩增。因此这不仅仅是一个被动的递送装置，还是一个释放平台，可以触发CAR-T细胞的扩增，从而克服肿瘤对免疫细胞的防御。
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2019年11月13日Cellectis公司的研究人员发表在Nature Communications上的研究显示，通过使用该公司专有的TALEN® 技术，重新利用T细胞活化途径的三个主要参与者TCRα、CD25和PD1基因，从而使得CAR-T细胞能够通过以肿瘤和时间依赖性方式微量分泌促炎细胞因子白介素12(IL-12)重塑肿瘤微环境。
这种新的“smart” CAR-T治疗方法能够通过微分泌治疗蛋白对肿瘤进行感知和反应，从而提高其对抗癌细胞的能力。这种严格控制工程化T细胞产生、分泌或递呈外源目的蛋白的新工程策略将对开发下一代基于T细胞的疗法有重要意义。
2020年1月2日，BioNTech公司在Science杂志上发布的一篇文章报道了该公司利用一种创新型的RNA疫苗方法CARVac，促进新型CAR-T疗法BNT211细胞扩增并保持其针对实体瘤的持久性疗效的临床前数据，BNT211是一种靶向癌胚抗原Claudin 6（CLDN6）的自体CAR-T细胞疗法（以4-1BB为共刺激域的第二代CLDN6-CAR-T）；此外，文章还提到CARVac作为广泛使用的RNA疫苗方法，能够显著提高CAR-T细胞疗法的功效。
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结语
近年来，众多科学家和企业已经做出了相当大的努力来开发新的策略来克服实体瘤障碍，并采用优化策略用于针对这些特定适应症的CAR-T疗法。我们期待着，越来越多的临床前/临床数据能拼凑成一幅完整的拼图，展示CAR-T治疗实体瘤的真实能力。
参考出处：
1.BioDrugs(2019)，https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs40259-019-00368-z
2.Nature Reviews Drug Discovery, DOI: 10.1038/d41573-019-00090-z
3.Nature Biotechnology：Interleukin-23 engineering improves CAR T cell function in solid tumors
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