快速无菌检查的法规更新与中外实践丨医麦课堂

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2020年5月7日/医麦客新闻 eMedClub News/--新冠疫情牵动着每一个人的心，包括疫苗在内的生物制品的研发，成为现下中国医药产业最热门的话题。如何实现加快放行，提升产业化速度，也成为同期在国内外获得热议的话题之一。从微生物指控的方面入手，快速无菌检查就成为值得一说的话题。

本期医麦课堂邀请梅里埃工业技术专家赵思扬先生做客，从当前传统无菌检测出发，就传统方法的不足引申出快速检测方法，并系统梳理了中外法规的相关章节。基于法规，全面评估快速无菌检测方法的适用性。借助各国企业的应用实践分析，展示快速无菌检测方法如何助力企业加速产品无菌检测与放行。

无菌检查法

无菌检查是用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料辅料及其他品种是否无菌的方法。生物制品，作为药典要求的无菌药品之一，必须在放行之前完成无菌检查。

自从1953年，我国发布第1版中国药典开始，无菌检查法就属于当仁不让的强制检查法。目前来说，在ICH协调案的作用下，国外的主流制药市场包括美国药典、欧洲药典和日本药典，都对无菌检查这一部分进行了融合、协调、一致。我国在2015版药典的更新上，也尽可能的在培养基体系、培养温度等方面，开始和融合药典接轨。

但无菌检查法本身拥有的方法局限体现为：供试品符合无菌检查法的规定仅表明供试品在该检验条件下未发现微生物污染。无菌检查不能够替代整个GMP的实施，以及严格的过程控制。随着目前无菌工艺的理念在用户范围内逐渐推广，配方中的微生物负载、厂房的设计，以及整体的灭菌工艺效果，都对最终产品的微生物负载有着密不可分的影响。

近年来，药典中无菌检查法暴露出的局限性主要体现为：

• 培养基的种类、培养温度和培养时间的选定是折中妥协的结果，并非所有微生物都能在此条件下良好的生长（有超过30%无菌检查失败发生在第7-14天）；

• 部分生物制品（如疫苗）会引起培养基变浑浊，从而影响判读，故必须进行转种；

• 检测并记录培养基的浑浊、絮状菌膜形成和沉淀积累，完全依赖操作者主观判读；

• 14天的培养时间无法满足药品效期的需求。

短效期产品不需要遵照无菌检查法

目前短效期产品不需要遵照无菌检查：

• 美国：先放行后召回

21 CFR 211.165章节提到供应产品的测试与放行：“当放射性药物等短效期产品施行无菌或热原检查时，该批次可能需在测试完成前放行，因此需尽快完成。”

USP已施行针对CSPs、PET造影剂、细胞和基因疗法产品等的<1071>.Rapid Microbial Tests for Release of Sterile Short-life Products: A Risk-basedApproach章节。

• 欧洲细胞疗法产品

EP9.2版本（2017年7月）中更新了2.6.27 Microbiological Examinationof Cell-based Preparations章节，考虑到产品的输注效期、本体构成和药品接种量，引入了基于生长的自动化方法；

这一法规的改动是配合FDA所批准的两例CAR-T产品进入欧洲市场。

替代方法验证

现阶段替代方法的应用需要经过验证后进行报批。

ICH协调案早在1997年Q2中即提出了分析程序验证的指南，目前该部分内容并未按照融合药典的要求保持一致（USP<1223>/EP5.1.6）。

现行《中国药典》四部9201章节为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法提供指导。如果出于成本、生产量、快速简便、提高质量等需要，检验方法不是药典或标准中规定的方法，使用前应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典方法。

• 专属性（specificity）：指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力

验证涉及的菌种除应包括《中国药典》四部1101章节中培养基/方法适用性检査规定的菌株外，还应根据替代方法及样品的特点增加相应的菌株，如考虑：

（1）环境菌库中有意义的厂房分离菌株；

（2）可能导致无菌检查失败的微生物（假阴性/假阳性）；

（3）同类产品召回历史上列明的微生物；

（4）用药途径相关的致病菌。

• 检测限（sensitivity/limit of detection，LOD）：指在替代方法设定的检验条件下，在稀释或培养之前初始样品中能被检出的微生物的最低数量

验证的方法是在样品中接种较低浓度的试验菌（每单位不超过5CFU）进行检验：

（1）接种量以药典方法50%样品可检出为宜，按照泊松分布基于生长的无菌检查理论LOD值为1CFU或3CFU；

（2）同一种试验菌采用卡方检验（χ2）来评价差异；

（3）至少应重复进行5次。

• 重现性（reproducibility/ruggedness）：指相同的样品在正常的试验条件发生变化时，所得检验结果的精密度

（1）验证由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂或仪器进行检验，采用卡方检验（χ2）来评价差异；

（2）可视为检验方法在一致样品上抵抗操作和环境变化的能力，应优先验证。

• 耐用性（robustness）：指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力

可视为检验方法正常使用的可靠性依据，应优先验证。

监管认可与法规更新

• FDA当局的支持与批准：

2004年药品评价研究中心的BryanRiley博士发表论文表示“快速微生物方法（RMMs）在制药工业的应用大有裨益，及早获取微生物学结果可以为生产工艺提供更好的控制，适当的验证是必要的”。

2015年举办的USP<1223>研讨会上，ErikaPfeiler博士首次代表FDA给出了关于替代微生物方法（AMMs）的立场：药品评价研究中心已经批准过AMMs用于水检测、环境监测、生物负载检测、微生物限度检查、无菌检查（包括放行及稳定性，频率约5次/年），FDA欢迎此类应用的提交，依据产品和工艺的各种验证都可接受。

• EP更新进展：

2.6.27 Microbiological Examinationof Cell-based Preparations

这是整个国际范围内药典体系里针对无菌检测第1次引入了自动化的方法学，虽然只是针对现下最热门的细胞治疗产品的法规。

• USP更新进展：

早在2015年7-8月，在线药典论坛上即公示了<1223>章节的修订稿，并于同年12月正式生效-本次修订的内容涵盖：CFU局限性的探讨、接受程序的概念、替代方法验证的结果对等性选项、非劣效性测试的统计学工具。

2016年启动新的尝试，成立当代微生物学方法专家组，由空白出发并最终达成一致：-为利益相关生产厂商开发易被接受的URS-为快速无菌检查药典方法向USP委员会推荐合适的技术。

2016年11月的委员会会议上，专家组进行了报告展示。

2017年专家组在在线药典论坛双月刊第43(5)卷（9-10月）上，以“Developmentof CompendialRapid Sterility Tests”为题发布刺激文章。

专家组除了考量上述基本指标外，还涵盖了：

（1）改善病患安全的目的性；

（2）法规接纳；

（3）可获得参考标准；

（4）仪器的耐用和可靠（低假阴/阳性率）；

（5）使用和数据判读简便；

（6）样品处理；

（7）无菌风险级别（开放与封闭系统）；

（8）方法适用性；

2018年9-10月，在药典论坛上公示了<1071>.RapidSterility Testing of Short-Life Products: A Risk-based Approach章节。

2019年12月正式生效，施行题目改为：RapidMicrobialTests for Release of Sterile Short-life Products: A Risk-based Approach。

现今，专家组继续在<1071>章节的基础上调研和起草<70.1-3>系列章节，对具有广泛实践基础的三类方法拟定强制性通则。

2018年6月发布《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》中规定：

在可行的情况下，首选药典方法用于无菌检查，但考虑到Car-T细胞产品的特殊性，也鼓励研究者开发快速的无菌检查法作为中间过程监测或放行检测方法，且在临床试验过程中须按照中国药典要求以及其它国际要求对快速无菌法进行充分验证。且在早期使用时，快速方法应与药典方法平行进行，在获得充分的比对数据后，结合无菌生产全过程的风险评估设计放行策略，才有可能替代药典方法。

中外实践案例

下面是USP和EP中收录的两个代表性的方法：

USP收载的固相细胞计数法：

• 适用于可过滤的样品检测

• 荧光酶活标记技术可协助区分出活的微生物细胞

• 可在约3.5h内获得结果

USP/EP收载的呼吸法：

• 适用于不可过滤的样品检测

• 微生物代谢中产生的CO2检测，无需依赖培养基浑浊的判读

• 可在7天内获得结果（用户可基于风险自行验证）

推荐阅读：

免疫细胞疗法是这一方法的成功应用案例。在2017年10月16日举办的PDA第12届全球微生物年会上，吉利德旗下的凯特制药分享了CAR -T细胞治疗产品使用快速替代方法进行最终放行的整体验证方案。在验证方案中，对该方法的专属性、检测线和最终报阳时间进行了非常全面的验证。通过该方法的验证，吉利德凯特制药正式采用这一方法学用于CAR-T细胞治疗产品的放行。复星凯特也研习了美国总部的全套微生物学检验方法。

诺华的CAR-T细胞产品最早获得FDA批准，在全球各个区域内以CDMO合作的形式广泛扩建CAR-T生产基地。诺华从美国新泽西州莫里斯平原生产厂向瑞士斯坦的新生产线进行方法转移时，选用呼吸法的方式来进行快速的产品放行。目前在中国，该公司与西比曼生物科技达成战略许可合作，向中国患者供应Kymriah。

另一个成功应用案例来自于普列威，早在2007年9月马里兰州贝塞斯达召开的体细胞疗法座谈会上，时任丹瑞QC科学家的Timothy D.Wood博士即分享了题为Validation of the BacT/ALERT as an Alternative Sterility Test for Dendreon’s Autologous Cell Therapy Product的主题报告，分享了2006年获批用于III期临床产品的验证经历。

赛诺菲旗下健赞在1999-2004年期间对RMM进行了先驱性的验证，并最早获得FDA批准应用于第一代软骨修复产品Carticel的微生物检测。John Duguid博士曾于2009年撰文对整个工厂3种自体细胞疗法产品快速检测方法开发的过程进行了总结。

除了这些细胞疗法的产品，利用发酵体系生产的一些单克隆抗体，也开始慢慢的在工艺中引入快速无菌检查。

目前在中国有大量的同行正在积极的尝试快速无菌检查，用于成品放行及过程控制，相信随着这些快速无菌检查手段的推广，我们一定能够迎来中国生物制品的春天。

直播互动

Q. 赵老师，快检的方法如果申报的话，申报老师会认可这个方法吗？

赵思扬老师：只要具备完善的验证资料，检方会按照实际数据进行审核认可的，目前我国也有先例。

Q. 赵老师，请问耐用性里温度的改变是指仪器孵育温度的微调还是指对设备所处环境温度进行变更？

赵思扬老师：其实法规只是要求刻意改变条件，如果是基于生长的方法的话温度是有意义的，微调设备温度相对比室温传导更可控一些，其他原理则会有其他相应的参数。

Q. 赵老师，方法学验证的话最少需要多少批次的数据才算是比较合理的，才是申报老师认可的数据？

赵思扬老师：不同的统计学指标评定合理的标准是不同的，以重现性为例，三个批次试剂采集的数据一般是符合实操常规的。

Q. 赵老师，100cfu每单位是每ml吗？

赵思扬老师：如果是指检测限的话，为了体现各原理的可比性，一般液态样本是以/mL为衡量的。

Q. 赵老师，客户现在用的是传统的检测方法，是马上替换成快检吗，这个里面怎么过渡？

赵思扬老师：关于替换进度没有硬性的规定，用户按照自身需求把握验证的进度，如果验证不充分是拿不到批件认可的。

Q. 赵老师，有限的取样量无法满足对批产品的无菌保证水平进行科学评价的统计学要求，这个问题赵老师怎么理解？

赵思扬老师：SAL本身是灭菌工艺来满足的而非通过检验手段，而目前法规承认AMM是基于风险的放行，如果课程中讲到的一定是有利弊权衡。

Q.  赵老师，选用快速检测方法选用的培养基还是TSB和FTM吗？滤筒还是选用原来的吗？

赵思扬老师：替代方法指的是和药典中不同的方法，因此不拘泥于滤筒，培养基各系统略有不同。

Q. 赵老师，无菌快速检查方法中，如何有效区分不可培养的微生物，指定的培养基和条件适不适合这些微生物生长？

赵思扬老师：这一问题要看选用的替代方法具体是什么，如果是基于生长的方法学答案是不能区分，但也有很多方法是非基于生长的，这样对VBNC就有可能识别。

Q. 赵老师，新版药典把快检纳入标准了吗？

赵思扬老师：USP中2019年12月有新的章节生效，EP是部分剂型选入了新的方法，目前中国药典尚无动作因此仍需参照9201。

Q. 赵老师，对于快速检测方法，取样量与上样量还是参考中国药典1101吗？

赵思扬老师：不是了，很多的操作细节还需要参照系统的SOP来确定，PQ的过程也可进行充分的摸索。

Q. 赵老师，普通无菌样品大多是大体积的薄膜过滤法，目前的快检系统大多是基于直接法，是否对大体积的样品有好的快检建议？

赵思扬老师：也有基于过滤的方法的，六类方法当中ATP法、固相法都有过滤样品的解决方案。

Q. 赵老师，ATP和固相法都是固体培养基支持培养吧，没法做到像直接培养法那样封闭原位检测？

赵思扬老师：不是的，这两个方法都有系统是前期滤膜过滤。

Q. 赵老师，基于固相技术的快检设备，3.5小时是指全部检测时间？不需要培养吗？

赵思扬老师：目前来说，USP选择的固相代表系统是原位扫描细胞体的，不需要培养，只需有一个激活的步骤。

Q. 赵老师，核酸扩增法有推荐的具体的选择吗？

赵思扬老师：PCR方法相对来说比较通用，具体的应用更多的是在通用平台中用户自行开发，因此USP专委会没有给出具体的型号，可以理解为“很多”。

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