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2020年6月14日/医麦客新闻 eMedClub News/--6月3日，David Liu教授团队运用新型单碱基编辑技术，成功恢复了隐性基因突变耳聋小鼠的听力，该研究发表在Science Translational Medicine 杂志上，这是人类首次将单碱基编辑技术用于遗传性感觉障碍疾病。
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该研究成果再次证明了碱基基因编辑技术的强大。目前，这类技术正广泛用于基因突变导致的遗传性疾病，前不久，邦耀生物更是在Nature Medicine、Nature Cell Biology、Cell Research等多种期刊上发文，表示开发出新型双碱基编辑系统。接下来，就让小编带大家看看单碱基编辑技术到双碱基编辑技术的发展历程吧！
现有的基因编辑技术，例如CRISPR、ZFN、TALEN，通过在DNA中产生靶向的双链断裂，然后依靠细胞自身修复机制来完成编辑过程。这种方法可以有效地破坏基因表达。然而，它们缺乏对编辑结果的控制，脱靶效应以及对DNA双链断裂的依赖，可能导致基因编辑后的细胞出现不可预期的混乱。许多基因组突变发生在单个碱基中，为使基因编辑更加精确，碱基基因编辑技术应运而生，旨在针对这些单一的碱基错误(即点突变)，而不会在DNA中造成双链断裂。2016年4月，David Liu等人在Nature上发表论文，首次开发出了胞嘧啶碱基编辑器（CBE），CBE（BE3.0）基于胞嘧啶脱氨酶APOBEC1（能催化C脱氨基变成U，而U在DNA复制过程中会被识别成T）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI（能防止尿嘧啶糖基化酶将U糖基化引起碱基切除修复）在不依赖DNA双链断裂的情况下首次实现了对单个碱基的定向修改。这便开启了CRISPR系统的单基因编辑时代。▲ CBE工作示意图：嘧啶碱基转换技术（C/G到T/A）2017年10月，David Liu团队又开发了另一种单碱基基因编辑工具——腺嘌呤碱基编辑器（ABE）发表在《Nature》上。它可以将A-T碱基对转换成G-C碱基对，加之CBE的将G-C碱基对转换成T-A 碱基对的成果，从此研究人员首次实现了不依赖于DNA断裂而能够将DNA四种碱基A、T、G、C进行替换的单碱基基因编辑技术。
▲ ABE工作示意图：嘌呤碱基转换技术（A/T到G/C）随后，David Liu团队在优化这些碱基编辑器性能上取得了多项成果和突破，但是单碱基编辑器虽然实现了更精准的基因编辑，仍具有局限性；它不能任意编辑所有碱基，例如目前仍无法执行另外八个碱基转换突变 （C→A，C→G，G→C，G→T，A→C，A→T，T→A和T→G），而且脱靶效应依然存在。2019年3月，中科院神经科学研究所杨辉研究团队和中科院遗传发育所高彩霞研究团队分别在《Science》 杂志上同期发表了两篇论文，两项研究分别在小鼠和水稻上证实：单碱基编辑系统存在严重的脱靶效应，同时会诱导大量的DNA突变。他们发现设计良好的CRISPR/Cas9以及单碱基基因编辑系统ABE没有明显的脱靶效应。与此相反的是，CBE系统可在小鼠胚胎以及水稻中导致大量的的脱靶性单核苷酸突变出现。2019年4月，麻省总医院病理学教授J. Keith Joung 领导在《Nature》杂志上发表的一篇论文显示：单碱基编辑的脱靶效应比想象中还要严重，它不仅会导致DNA突变，还会导致大量RNA突变。CBE和ABE这两种重要的DNA单碱基编辑器均存在大量的RNA脱靶，并且利用点突变的方法筛选到一个CBE的突变体可以降低RNA的脱靶。紧接着在2019年5月，David Liu团队在Science Advances杂志报道的另一项研究显示：一种ABE的突变体ABEmaxAW能够降低RNA的脱靶数量，同时保持DNA的编辑活性，但是值得注意的是，该突变体并未将RNA脱靶降低至对照组的水平，同时DNA的编辑的效率也有所下降。
自2016年单碱基基因编辑技术被报道后，该技术迅速成为了基因编辑技术领域的一颗璀璨的“明星”，科学家也对其进行着不断地改进，但单碱基编辑技术依旧存在其固有的局限性：脱靶效应、编辑窗口单一、编辑转化效率不高等。因此，急需开发新的技术以弥补这些不足。
2019年6月，中科院神经科学研究所杨辉研究团队、四川大学郭帆研究组、中国科学院-马普学会计算生物学李亦学研究组在Nature杂志报道的一项研究发现：RNA脱靶主要是由于DNA单碱基编辑器的脱氨酶APOBEC1（BE3）和TadA（ABE）所导致。研究团队通过引入突变的方法对两种DNA单碱基编辑器的胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶分别进行了优化，最终获得了3种高保真度的BE3突变体，均能够完全消除RNA脱靶并维持DNA编辑活性的高精度单碱基编辑工具；但遗憾的是，胞嘧啶单碱基编辑器的DNA脱靶依然没有得到解决。2019年10月，David Liu团队在Nature杂志上发表论文表示，开发出了先导编辑器(Prime Editor, PE)，一种能够搜索和替换（碱基）的基因编辑器，在不依赖DSB和供体DNA的条件下便可有效实现所有12种碱基转换（C→T、G→A、A→G、T→C、C→A、C→G、G→C、G→T、A→C、A→T、T→A和T→G），此外还能有效实现多碱基的精准插入；最多插入44个碱基，或删除80个碱基。这有望修复大约89%的已知人类致病变异(已知的有75,000多种)。该项成果不仅使编辑效率大大提高，而且脱靶效应更低。2020年2月，David Liu团队在Nature Biotechnology发表了一篇论文，该研究基于细菌抗性筛选方法，对多种CBE系统的Cas9非依赖型DNA脱靶风险进行了系统性的分析与比较，发现以APOBEC1的多种突变体如YE1、YE2、EE、YEE、R33A和R33A/R34A为基础的CBE系统有着最低的Cas9非依赖型DNA脱靶风险，并发现YE1是最好的版本，碱基转化效率不变，DNA和RNA脱靶同时减少。之后研究者还通过蛋白质工程等策略对CBE系统进行优化，有效地减少了Cas9非依赖型DNA脱靶风险的发生。2020年5月，杨辉研究团队、李亦学研究组和中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究组合作在Nature Methods杂志上在线发表的研究论文，根据蛋白结构预测了脱氨酶ssDNA结合的重要氨基酸，在不影响催化活性的情况下，突变相应的氨基酸（APOBEC1上的ssDNA结构域相应氨基酸），从而得到了显著降低DNA脱靶的CBE突变体。
该研究结果和David Liu团队在2020年2月发表的研究结论一致，都报道YE1在保持较高的编辑效率的同时降低了DNA和RNA上的脱靶，并且同时缩小了编辑窗口并降低了indel产生的比例。但是David Liu团队基于细菌抗性筛选的方法只适用于CBE，而杨辉团队基于GOTI（一种新型脱靶检测技术）的方法是不受限制的，不仅可以检测单碱基编辑器，还可以用于其它基于融合蛋白的基因编辑工具的安全性检测和改进。
尽管上述改进方法降低了潜在的脱靶效应，但很难追求更高的编辑效率和更宽的编辑窗口。现有的碱基编辑器只能催化单一类型碱基C或A，这在较长时间和很大范围内限制了其广泛应用。因此，开发一种简单且高效的碱基编辑器，一直是碱基编辑器优化探索的重点和难点。
2020年5月11日，华东师范大学李大力课题组在Nature cell Biology发表了一篇研究论文，该研究将Rad51蛋白的单链DNA结合结构域融合到Cas9与脱氨酶之间，极大地提高了胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的编辑活性，拓宽编辑窗口，因此将其命名为超高活性CBE(hyBE4max)；类似地还改造出具有更宽的编辑窗口和更高活性的hyA3A-BE4max，以及能更高效识别TC碱基模块中的C(胞嘧啶)而不引起其他C突变的hyeA3A-BE4max。
随后，2020年6月1日，邦耀生物与华东师范大学刘明耀教授及李大力教授团队合作的一项研究在Nature Biotechnology杂志进行了发表。
该研究将胞嘧啶脱氨酶hAID-腺嘌呤脱氨酶-Cas9n（SpCas9 D10A突变体）融合在一起，开发出了一种新型双功能碱基编辑器-命名为：A&C-BEmax，它不仅可以实现单独的C>T或A>G，还可以在同一等位基因上同时实现C>T和A>G的高效转换。与已报道单碱基编辑器（ABE或CBE）相比A&C-BEmax可使 C>T的编辑窗口被拓宽，效率得以提升；A>G的窗口保持不变，效率略微下降；RNA脱靶水平大大降低。
巧的是，也在6月1日，J. Keith Joung 团队将腺苷脱氨酶(TadA)、来源于七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶（PmCDA1），分别融合到Cas9切口酶德的N端和C端。开发除了一种基于CRISPR–Cas9的同步可编程腺嘌呤和胞嘧啶编辑器（Synchronous Programmable Adenine and Cytosine Editor，简称SPACE），可以同时引入A-G和C-T替代。 SPACE双碱基编辑器与胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）相比，SPACE的C-T编辑效率与CBE相当，对A-G编辑效率则略有降低，而总体来说，SPACE双碱基编辑器效率高于CBE+ABE。SPACE扩大了可能的DNA序列改变的范围，拓宽了CRISPR碱基编辑器的研究应用。
基于以上研究，双碱基基因编辑技术的出现极大地丰富了碱基编辑工具、扩展了碱基编辑器的应用范围，为遗传病治疗、作物育种等于带来新的发展，可以说是人类的在基因编辑领域的新突破。（1）实现两种碱基高效转换：在只有一个靶点引导的情况下，就可以诱导靶位点C>T和A>G的同时突变，能对临近的CA碱基同时进行CA→TG的碱基替换，实现双碱基基因编辑。（2）编辑窗口的扩增：经典的CBE与ABE编辑工具在单独使用时具有5-6nt左右较窄的碱基编辑窗口，而整合形成的双碱基基因编辑工具的碱基编辑窗口在李大力等的报道中则C→T与A→G的窗口分别扩增到了16与13个核苷酸。但从另一方面而言，编辑窗口的扩张代表着碱基基因编辑工具在进行单碱基基因编辑时精确性与特异性的降低，也暗示着在打靶位点约20bp的片段内容易出现不符合预期的突变情况。然而有意思的是，编辑窗口以及可编辑碱基类型的增加，或许更适合用作为高通量筛选工具另外，据研究报道，双碱基编辑具有更低的脱靶效应，到但其安全性仍需要进一步的验证和评估。截止目前，碱基基因编辑技术的不断更新发展，为生物学领域和研究提供了巨大的帮助，双碱基技术的出现更是为基因编辑工具的发展方向及其在各领域中的广泛应用提供了更多的参考，并为我们更进一步地开发与利用碱基基因编辑工具提供了新的思路。期待未来，该技术能应用于实践，为广大患者提供更优质的治疗方法！聚焦肿瘤免疫、新型抗体、干细胞再生医学、基因治疗等四个热门生物医药领域，2020 BPIT 生物药创新技术大会将在中国南京国际青年文化中心拉开帷幕，相约2020年7月19-21日！
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