Nature重磅：David Liu突破性开发全新基因编辑系统，相关公司竟已成立丨医麦猛爆料

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2019年10月22日/医麦客 eMedClub/--今日，一项开发出全新的基因编辑工具Prime editing（Prime编辑）的研究发表在Nature杂志上，引起了业内广泛关注。该研究来自Broad研究所David Liu（刘如谦）团队，Prime编辑无需依赖DNA模板便可有效实现所有12种单碱基自由转换，而且还能有效实现多碱基的精准插入与删除，最多插入44个碱基，或删除80个碱基。这有望修复大约89%的已知人类致病变异(已知的有75,000多种)。

针对碱基的基因编辑工具

现有的基因编辑技术，例如CRISPR、ZFN、TALEN，通过在DNA中产生靶向的双链断裂，然后依靠细胞自身修复机制来完成编辑过程。这种方法可以有效地破坏基因表达。然而，它们缺乏对编辑结果的控制，脱靶效应以及对DNA双链断裂的依赖，可能导致基因编辑后的细胞出现不可预期的混乱。

许多基因组突变发生在单个碱基中，为使基因编辑更加精确，碱基基因编辑技术应运而生，旨在针对这些单一的碱基错误(即点突变)，而不会在DNA中造成双链断裂。David Liu（刘如谦）教授可称得上是该领域的领军人物之一，近年来硕果累累，引领了针对碱基的基因编辑工具的发展。

▲David Liu（刘如谦）教授

2016年4月，David Liu（刘如谦）等人在 Nature 发表论文，在 J. Keith Joung 研究的基础上首次开发出了CRISPR-Cas9单碱基编辑器（CBE），CBE（BE3.0）基于胞嘧啶脱氨酶APOBEC1（能催化C脱氨基变成U，而U在DNA复制过程中会被识别成T）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI（能防止尿嘧啶糖基化酶将U糖基化引起碱基切除修复）在不依赖DNA双链断裂的情况下首次实现了对单个碱基的定向修改。从此开启了CRISPR系统的单基因编辑时代，给基因编辑领域带来了巨大的惊喜，对众多单碱基遗传病来说具有绝对的优势。

2017年10月25日，该团队又开发了另一种单碱基基因编辑工具——腺嘌呤碱基编辑器 (ABE)发表在《Nature》上。它可以将A-T碱基对转换成G-C碱基对，加之CBE的将G-C碱基对转换成T-A 碱基对的成果，从此研究人员首次实现了能在不依赖DNA双链断裂的情况下有效的进行四个碱基转换突变（C→T，G→A，A→G和T→C）。

近年来，David Liu团队在优化这些碱基编辑器性能上也取得了多项成果和突破，但是单碱基编辑器虽然实现了更精准的基因编辑，仍具有局限性；它不能任意编辑所有碱基，例如目前仍无法执行另外八个碱基转换突变 （C→A，C→G，G→C，G→T，A→C，A→T，T→A和T→G），而且脱靶效应依然存在。这就是此次发表的研究成果，Prime编辑所突破的问题。

Prime编辑工具在Cas9酶和gRNA两方面进行了重大改造，可在人细胞中介导靶标插入，缺失以及所有12种可能的碱基间转换及其组合，而无需DNA双链断裂或供体DNA模板。

• 改造gRNA：在其3’末端增加了一段RNA序列，形成pegRNA；与普通的gRNA不同，这种pegRNA不但具有引物结合位点（PBS）,能够结合想要进行编辑的特定DNA区域，还自带逆转录的模板（RT模板）,其上携带有目标点突变或插入缺失突变以实现精准的基因编辑。

• 改造Cas9酶：将Cas9酶的变体（H840A突变型，只切断含PAM的靶点DNA链）与逆转录酶融合，形成融合蛋白复合体。Cas9-逆转录酶融合蛋白会在pegRNA的引导下，精准地切开一条DNA链，然后根据RT模板，合成含有正确序列的DNA，细胞内的DNA修复机制会自动把这段新合成的序列整合进基因组。另一条DNA链也进行同样的操作，使两条DNA都得到正确的编辑。

▲图a 改造后的pegRNA结构，图c Prime编辑工具的基本原理（图片来源：参考出处1）

研究人员使用Prime编辑在人细胞中进行了175次以上的编辑，包括靶向插入，删除和任意单碱基的替换（12种类型），而无需双链断裂或供体DNA模板，成功修复了导致镰状细胞性贫血症（A突变成T）和Tay-Sachs病（HEXA基因发生突变，多出4个碱基）的基因突变，不仅效率大大提高，而且脱靶效应更低。

碱基基因编辑的另一巨头

对于人体DNA的改变任何时候都应当谨慎对待，尤其是可遗传的改变。并且，使用CRISPR / Cas9介导的DNA编辑难以编辑某些细胞类型，例如神经元，因此对于一些影响大脑的破坏性疾病，基于CRISPR的DNA编辑一度有些无能为力了。

▲张锋教授

2017年，就在腺嘌呤碱基编辑器 (ABE)发表的同一天，张峰团队的CRISPR新系统“REPAIR”，一种RNA单碱基编辑器在国际学术期刊《Sience》上发表。“REPAIR”的基本元件是一种取名为PspCas13b的酶和ADAR2蛋白。与常见的Cas9不同，Cas13蛋白只靶向RNA，使得“REPAIR”可高效地修复RNA的单个核苷，不会改变DNA信息而更为安全，将为基础研究和临床治疗提供一个新的工具。

2017版的“REPAIR”是将RNA靶向CRISPR-Cas13（dCas13）与ADAR2的腺嘌呤脱氨酶结构域融合，然后利用dCas13将RNA编辑器的活性结构域ADAR2引导至特定的RNA转录物，特异性地将RNA上的腺嘌呤A转化为与鸟嘌呤G结构类似的肌苷I。在人类的疾病中，由鸟嘌呤（G）向腺嘌呤（A）的突变极为常见。类似的突变能在罹患局灶性癫痫（focal epilepsy）、杜氏肌营养不良、或是帕金森病的患者体内找到。因此，逆转这一常见突变，就有望从根源上治疗这些疾病。

2019年7月11日，张锋团队在Science 在线发表研究论文，介绍了基于CRISPR系统开发出的一种新型RNA单碱基基因编辑工具（RESCUE）。该研究在“REPAIR”的基础上改进了RNA编辑器的活性结构域ADAR2，通过定向蛋白进化将ADAR2转化为胞苷脱氨酶，改进后的ADAR2能够将胞嘧啶C转化为尿嘧啶U，称为特定C到U交换的RNA编辑。与此同时，它原先将A转化为I的功能依旧得到了保留。

相关公司已创立

据了解，刘如谦教授已围绕这项新碱基编辑技术（Prime编辑）创立了新公司 Prime Medicine，并已获得麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所对该技术的独家许可授权。

刘如谦教授与张锋教授是CRISPR技术的主要发明人之一，一直致力于这项技术的开发和临床推进，先后联合创建了三家基因编辑领域公司：基因编辑医疗公司Editas Medicine、单碱基编辑公司Beam Therapeutis、基因编辑农业公司Pairwise Plants。

▲张锋教授（左）、刘如谦（David Liu）教授（中）、J. Keith Joung教授（右） 

其中Beam Therapeutis2018年5月成立，是首个利用碱基编辑技术开发全新疗法的公司，近日已经提交上市申请，拟纳斯达克IPO募集1亿美元。除了刘如谦团队开发的碱基基因编辑技术，Beam还获授权使用张锋实验室开发的REPAIR碱基编辑器。而且，根据Beam公司的招股书内容，它还从Prime Medicine获得了可在某些领域使用该技术的转许可。

2013年成立的Editas Medicine在2016年已经成功在美国上市，并在今年7月25日，和合作伙伴艾尔建(Allergan)宣布启动CRISPR疗法AGN-151587 (EDIT-101)的I/II期临床试验。这项临床试验将是全球首个基于CRISPR的在体研究。据悉，此次Prime编辑成果的发表，使其股票大涨。

未来，拭目以待

对于这项技术里程碑式的突破，Nature杂志评论其是“超精确的新型基因编辑工具”， Science 杂志评论它是“超越CRISPR”的重大突破，哈佛大学教授，CRISPR先驱George Church盛赞这一成果：“朝着正确方向迈出的一大步”。但也正如加州伯克利创新基因组研究所的科学主任Fyodor Urnov在Nature杂志上评论这篇论文时所说的：“Prime编辑很可能成为修复致病突变的方式，但现在下结论还为时过早，这项技术‘今年才出现’”。

未来，Prime编辑将如何发挥其应用价值，我们拭目以待！

参考来源：

1.原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-019-1711-4#article-info

2.https://www.statnews.com/2019/10/21/new-crispr-tool-has-potential-to-correct-most-disease-causing-dna-glitches/

3.https://www.sciencemag.org/news/2019/10/new-prime-genome-editor-could-surpass-crispr

4.https://www.genengnews.com/insights/genome-editing-heads-to-primetime/

4.https://www.sec.gov/Archives/edgar/data/1745999/000119312519257401/d734398ds1.htm

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