微载体放大培养在疫苗、溶瘤病毒和病毒载体生产中的应用 I 医麦课堂

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2020年6月18日/医麦客新闻 eMedClub News/--近年来溶瘤病毒、病毒载体和新型疫苗的研发项目越来越多，这些新型的生物制品很多都需要通过贴壁细胞培养生产。传统的工艺贴壁细胞通常通过T-Flask、滚瓶、细胞工厂等进行培养，培养规模相对有限，且很难进行工艺放大。使用微载体结合一次性的生物反应器进行贴壁细胞培养，是一种很好的解决方案。

本期医麦课堂我们邀请到了Cytiva Fast Trak工艺开发实验室上游经理高级工程师杨建军博士做客直播间，就微载体放大培养在疫苗、溶瘤病毒和病毒载体生产中的应用进行案例分析和干货分享。

微载体在一次性生物反应器的放大培养

该研究的目的是要探索Vero细胞及微载体的球转球放大工艺，随后将Vero细胞微载体放大培养，通过球转球逐级放大到XDR200L的一次性生物反应器。

微载体细胞培养放大过程中需要关注的要点：

• 贴壁细胞在微载体间很难自动转移
  
• 细胞需要通过蛋白水解酶进行消化（trypsin，collagenase，Accutase™，Pronase™，TrypLE...）
  
• 消化过程重点优化消化液种类、加入消化液的浓度、消化温度、消化时长、消化终点判断，及消化液中和方式等
  
• 需要加入蛋白酶中和剂或进行足够倍数的稀释以减小蛋白酶对细胞后续贴壁及生长的影响
  
• 可将细胞与老球一起转入下一级反应器，或将细胞与微载体分离只将细胞转入下一级反应器
  

所以Vero细胞微载体消化方法的建立是成功放大的关键：

• 不含Ca2+和Mg2+的DPBS润洗微载体2-3遍

• 加入2⨉Trypsin消化20-30分钟

• 使用含10%血清培养基终止消化

▲ 1.消化10min；2.消化25min；3.消化后润洗四遍；4.血球计数板活率照片。

在操作过程中，使用搅拌式生物反应器对微载体进行细胞培养，测定最低搅拌转速非常关键，细胞培养时搅拌转速过低，可能会造成微载体沉降，细胞生长不好。在使用XDR 50L生物反应器进行微载体培养时，首先使用了10、15、20 、25、30、35、40及45个rpm分别测定了在不同搅拌转速下对微载体混合的影响。每一个搅拌转速搅拌15分钟后取样。

取样后，通过Mettler Toledo水分测定仪，将样品烘干后测定微载体含量。微载体含量达到相对一致时即为最小搅拌转速。

通过研究可以确定25rpm为50L生物反应器微载体培养的最小搅拌转速。

接下来通过单位体积轴功率来推导XDR50L生物反应器的合适的搅拌转速。

又通过科尔莫戈罗夫漩涡尺寸公式进行验证，当搅拌转速为39个rpm时，我们可以推导出它的漩涡尺寸为92μm。

这时的漩涡尺寸显著大于细胞直径，同时又显著的小于微载体的直径，因此这个搅拌转速不会对细胞和微载体产生负面影响。

同理可得XDR200L生物反应器微载体培养的搅拌转速为62个rpm。

▲ Vero细胞在50L和200LXDR一次性生物反应器中的培养

1.XDR50L细胞接种过夜；2.XDR50L Day 4细胞；3.XDR200L 细胞接种过夜；4.XDR200L Day 4.5细胞

▲ XDR50L和XDR200L中Vero细胞生长曲线及比生长速率

由图可见，50L和200L反应器中细胞密度曲线和比生长速率无明显变化，可以确定已经成功建立Vero细胞在200L规模的球转球放大培养工艺。

Vero细胞在无血清培养基及微载体中的培养

使用无血清培养基进行贴壁细胞的培养，生产疫苗和溶瘤病毒是将来发展的趋势。因此需要开发Vero细胞等贴壁细胞在无血清培养基和微载体中的放大培养工艺。

▲ 1.细胞接种6小时；2.细胞生长至Day 4；3. 2*TrypLE™ Select微载体消化20min；4.消化后细胞活率检测

▲ 无血清微载体培养用于溶瘤病毒生产

 Day 5接毒前（左）接毒后Day 3（右）

微载体灌流培养用于狂犬疫苗生产

在疫苗生产过程中，如果使用的微载体浓度过低，相对而言细胞密度一定是比较低的。为了提高细胞密度，可以使用相对较高浓度的微载体。

首先使用了小型的生物反应器进行Vero细胞的培养，使用的微载体的浓度是18g/L，并采用灌流培养的方式。经过5天的培养，细胞在小型反应器里边细胞密度可以达到9.6⨉10⁶cells/ml。随后通过胰酶对微载体上的细胞进行消化，并将细胞和微载体同时转入到XDR50L生物反应器，进行放大培养。

基于提高微载体浓度和细胞密度的需求， Fast Trak新设计了一款可以XDR反应器连接的微载体截留装置，可以把载体的浓度提高到12~18g/L以上。

细胞通过球转球放大以后，进入XDR50L生物反应器灌流培养。细胞接种到XDR50L以后，经过24小时培养，细胞在微载体上再进一步贴壁。在整个灌流培养过程中，并没有发现微载体截留装置的堵塞现象，以及没有出现微载体在截留装置中的粘附现象，这说明可以进一步提高微载体浓度，更高的微载体浓度意味着更高的细胞密度，意味着更高的病毒滴度。

细胞达到最高密度以后，更换为低血清的培养液，随后进行接毒。

                  ▲ 接毒后Day 3（左）接毒后Day 15（右）

由图可知，在整个收毒过程中，细胞密度相对较高，病毒滴度相对来说也是较高的。通过这个研究建立了Vero细胞通过灌流培养，在一次性的XDR50L生物反应器进行狂犬疫苗的生产工艺。

微载体放大培养用于病毒载体生产

传统病毒载体生产工艺及其局限性：

• 传统HEK293T细胞共转染4个质粒进行慢病毒载体包装生产。
  

• 使用10层细胞工厂，培养规模较小，无法进行工业化放大。

• 随着更多细胞治疗项目和基因治疗项目进入临床或上市，建立可避免交叉污染的大规模病毒载体生产工艺就变得非常必要。

1.建立HEK293T细胞微载体培养球转球的方法

HEK293T细胞在Cytodec-1上的生长情况：

▲ 1-4为Day0-Day3的细胞生长情况

将HEK293T细胞在125ml和500ml培养瓶中进行球转球培养，使用1*Trypsin消化，进行球转球扩增，球转球前后细胞比生长速率无明显变化。

▲ HEK293T细胞微载体放大培养工艺路线

2.建立HEK293T细胞及微载体在一次性生物反应器中的放大培养

▲ HEK293T细胞在XDR50L生物反应器中的放大工艺研究

1为细胞接种后4h；2-5为Day1-Day4细胞生长情况；6为XDR50中微载体消化情况

3.建立HEK293T细胞微载体培养多质粒共转染及病毒载体包装工艺

在这里使用了PEI包装试剂，共转染了4个质粒，进行慢病毒载体的包装工艺开发。

▲ 微载体培养方式生产病毒载体的优势

小结

首先设计和开发了一个微载体截留装置，截留装置可以跟可抛弃式的生物反应器进行外部连接，实现微载体的高密度培养，微载体浓度可以达到12g/L以上，微载体密度的提高意味着更高的细胞密度，病毒滴度更高。

第二，建立了Vero细胞以及微载体，通过灌流培养方式，在可抛弃式的XDR50L反应器实现狂犬病疫苗的生产。在本操作中能够连续收获12天以上的病毒培养液。

第三，实现了无血清培养基以及微载体，进行溶瘤病毒生产工艺的建立。通过这个工艺，可以将溶瘤病毒的生产放大到50L-200L的一次性生物反应器。

最后建立了HEK293T细胞以及微载体在XDR50L的球转球放大工艺，同时也建立了通过微载体进行病毒性载体的放大生产工艺。

直播互动

Q. 胰酶洗脱细胞，对下游纯化会造成哪些影响，胰酶是动物来源的，有问题吗？

Cytiva杨建军：胰酶消化细胞后，将细胞转入下一级反应器，胰酶会被血清中和，且随后培养过程中的换液也会降低胰酶浓度，对纯化不会造成影响。

Q. 无血清和有血清，哪一种微载体贴壁率高？

Cytiva杨建军：相对于无血清培养，有血清培养的微载体贴壁效率更高。

Q.  无血清情况下，如何提高微载体的吸附率？

Cytiva杨建军：在无血清微载体培养中，残留的Tryple会对细胞在微载体上的再次贴壁生长造成影响，因此一般会加入Trypsin Inhibitor或通过培养液稀释的方法降低消化液对细胞后续贴壁的影响。

Q.  请问如果细胞长满微载体后，球与球之间的出现结团的现象，应该怎么处理？

Cytiva杨建军：球与球的粘连更多是跟细胞类型有关，越贴壁不牢的细胞，微球越容易粘连，比如HEK293T细胞，这时使用全新球，不用老球，状况可明显改善。

Q.  新球也会黏连比较严重，有没有好一点的解决办法？

Cytiva杨建军：新球若粘连比较严重，可使用相对较高的转速，另外在消化时注意消化终点的判断，避免消化时间过长。

Q.  对于干细胞的培养，加入的胰酶或者胰酶中和剂，会对收获细胞产生影响吗？

Cytiva杨建军：在干细胞微载体培养中，为了避免引入外源试剂，建议使用培养液稀释的方法降低消化液对细胞贴壁的影响。

Q.  黏连严重是不是因为搅拌速度过大而造成细胞破损啊？

Cytiva杨建军：在我看来，黏连严重并不是因为搅拌速度过大而造成细胞破损造成的，更多还是因为细胞类型。有些类型的细胞在微载体培养中确实容易造成微载体粘连。

Q.  请问微载体密度是多少g／L培养？

Cytiva杨建军：微载体批培养时浓度一般为3-5 g/L，但我们现在可以做灌流培养，微载体浓度可以提高到12g/L以上。效率可以更高。

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下期预告

本期医麦课堂有幸邀请到Cytiva中国企业解决方案BD经理雷杨教授做客，与大家分享KUBio™ Box病毒载体整体工艺流程的挑战和解决方案。

如何满足病毒载体生产的灵活性和可扩展性；
如何在10-12个月建成满足病毒载体生产的BSL-2 GMP 设施；
让我们一起来探索KUBio™ box吧！

Cytiva可提供一站式病毒载体解决方案，帮助打破工艺瓶颈，助力上市，造福患者！

2020年6月18日（周四）

20:00-21:00

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雷杨，Cytiva中国企业解决方案BD经理

-10年生物制药行业服务经验，具备企业整体解决方案以及多个灵活工厂项目经验（从厂房可行性研究，概念设计到详细设计、施工、调试、确认和交付等）

-一次性技术的产品技术支持

-大客户管理经验，如上海复宏汉霖，海正药业，上海医药等

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