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2020年8月10日/医麦客新闻 eMedClub News/--近日，来自丹麦哥本哈根大学、中国山东大学和华中农业大学的研究人员，在一项新的研究中利用先进的低温电镜（CryoEM）技术成功地可视化了最大最复杂的CRISPR/Cas系统的三维结构。研究人员认为，该系统可能在生物医学和生物技术方面具有潜在的应用价值，相关研究结果发表在Molecular Cell期刊上。
CRISPR/Cas9可能是最著名的CRISPR/Cas系统，也是俗称的“基因剪刀”。CRISPR/Cas9只是众多CRISPR/Cas系统中的一种，在这项新的研究中，研究人员解析出并分析了迄今为止发现的最大、最复杂的CRISPR/Cas系统的原子结构。研究者研究了一种称为Cmr-β的复合物，它属于III-B型CRISPR/Cas复合物的一个亚组。Cmr-β在目标RNA识别后，会针对入侵的遗传因素产生多方面的免疫反应，包括单链DNA（ssDNA）裂解，环状寡聚腺苷酸合成，以及独特的UA特异性单链RNA (ssRNA)被Cmr2亚基水解。
▲图片来自Molecular Cell
论文共同通讯作者、哥本哈根大学诺和诺德基金会蛋白研究中心的Guillermo Montoya教授说，“我们解析出迄今为止所看到的最大、最复杂的CRISPR/Cas复合物的三维结构。我们如今了解了这种系统是如何在分子水平上发挥作用的。”CRISPR是在细菌以及其他生物中发现的系统，它参与细菌的免疫系统。在这里，它在不断对抗入侵的噬菌体（一种攻击细菌的病毒）中起着主要作用。在这项新研究中，研究人员分析了Cmr在免疫系统中的作用，并深入研究了Cmr对噬菌体的免疫反应背后的机制及其调控方式。论文共同第一作者、哥本哈根大学诺和诺德基金会蛋白研究中心博士后研究员Nicholas Heelund Sofos说，“通过与科学学院的She小组合作，我们的发现突出了III型CRISPR-Cas复合物的多样化防御策略。我们还发现了一个名为Cmr7的独特亚基，它似乎控制了这种复合物的活性，我们进一步认为它可能会抵御潜在的病毒抗CRISPR蛋白。”在这项新研究中，研究人员绘制的Cmr系统可以去除单链RNA和DNA，但由于它太大而太复杂，很难像CRISPR/Cas9那样用于基因编辑。但是在将来，对理解细菌的免疫反应仍然可能是关键，它可能在对抗抗生素耐药性方面有一定用途。Montoya表示：“这种复合物在细菌和噬菌体之间的斗争中起着重要作用。抗生素抗性源于这种斗争。因此，我们的研究结果可能为抗击抗生素抗性提供重要的知识参考。该复合物也可能具有治疗潜力。也许可以将其用于诊断甚至是我们尚未发现的健康问题。现在，我们的目标是寻找该系统的应用。”
如上所述，CRISPR/Cas9是目前最著名的CRISPR/Cas系统，可能也是开发最大的一个CRISPR/Cas系统，其在2012年被发现，通常简称为CRISPR，它使科学家能够在特定的点对DNA进行精确的改变，并可能改变遗传疾病的治疗。CRISPR是在细菌中被发现，作为帮助它们抵御病毒的机制的一部分。CRISPR的基因序列可以引导Cas9（一种起分子剪刀作用的酶）到达基因组的特定位置， 使科学家可以移除一个基因，从而通过微调基因组来改变其功能，或者调节基因活动。大多数科学家担心编辑遗传基因的伦理问题，但许多人依然对通过编辑只影响患者的基因治愈疾病的机会而感到兴奋。而在CRISPR技术的发展中，我们不得不提的是这项技术的三巨头。2012年8月17日，詹妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna）和埃玛纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanulle Charpentier）合作，在 Science 杂志发表了基因编辑史上的里程碑论文，成功解析了CRISPR/Cas9基因编辑的工作原理。2013年2月15日，张锋在 Science 杂志发表了首次将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于哺乳动物和人类细胞的研究结果。自此，近年来生命科学领域最耀眼的技术正式宣告诞生，杜德娜、卡彭蒂耶、张锋三人，也被人们称为CRISPR三巨头。张锋率先创建了Editas Medicine公司，詹妮弗·杜德娜创建了Intellia Therapeutics公司，埃玛纽埃尔·卡彭蒂耶创立了CRISPR Therapeutics公司。这三家公司均已上市，他们与以四川大学华西医院肿瘤学家卢铀教授团队、北京大学邓宏魁教授团队、以及美国宾夕法尼亚大学Carl June教授团队为代表的科研机构单位，在推动CRISPR技术的发展上起到了重要作用。
随着CRISPR基因编辑技术的发展，除卢铀教授团队外，其他机构和公司团队基于CRISPR技术的人体临床试验也在去年开始陆续展开，其中不仅包括CRISPR的体外编辑，还有在体实时编辑的临床研究也取得了较大进展。
埃玛纽埃尔·卡彭蒂耶创办的CRISPR Therapeutics公司是第一家将基因编辑技术用于人类的生物制药公司，它针对已知的疾病（如β-地中海贫血和镰状细胞病）在体外进行编辑。其领先的候选产品CTX001是基于和Vertex公司之间的共同开发和商业化协议开发的，CTX001是一种实验性的、自体的、CRISPR基因编辑的造血干细胞疗法，目前正在欧洲和美国对患有输血依赖性β地中海贫血(TDT)或严重镰状细胞病（SCD）的患者进行1/2期临床试验，正在欧洲进行的1/2期临床试验是首个由制药公司发起的CRISPR临床试验，并且是欧盟批准的首个。2019年2月，第一名TDT患者在德国的1/2期临床研究中接受了CTX001治疗，这标志着该公司首次在临床试验中使用CRISPR/Cas9疗法。2019年4月16日，美国FDA授予CTX001快速通道指定，用于治疗输血依赖性β地中海贫血(TDT)。对于CTX001治疗镰状细胞病(SCD)，2019年1月，美国FDA授予其针对SCD的快速通道指定。同年7月，第一名美国镰状细胞病(SCD)患者接受了CTX001的治疗。这是美国首次将CRISPR疗法用于治疗遗传性疾病。此外，欧洲药品管理局(EMA)等多个国家的监管机构已经批准了CTX001用于TDT和SCD的临床试验申请。2019年11月，该公司公布了目前两名接受CTX001治疗的患者积极的安全性和有效性数据，这些患者的成功帮助该公司在后续普通股发行中筹集了逾2.7亿美元。2020年3月5日，张锋创办的Editas Medicine和合作伙伴艾尔建(Allergan)宣布其CRISPR疗法AGN-151587 (EDIT-101)治疗Leber先天性黑蒙10(LCA10)患者的I/II期临床试验Brilliance完成了首例患者给药，这项在2019年7月25日启动的临床试验是全球首个在体CRISPR基因编辑临床研究。AGN-151587(EDIT-101)本质上是装载有CRISPR/Cas9蛋白及两个sgRNA的AAV5病毒，通过视网膜下注射直接注射到患者感光细胞附近，将基因编辑系统递送到感光细胞中。此次给药是CRISPR基因编辑技术发展的又一次里程碑，目前只有另一家公司Sangamo Therapeutics在体内进行基因编辑，它使用更老的锌指蛋白酶(ZFN)技术治疗代谢疾病。>>>> Intellia Therapeutics
詹妮弗·杜德娜创办的Intellia，意在针对在Ex Vivo与In Vivo基因治疗开发出专有的革命性产品，使用成熟的细胞传输技术来充分发挥、拓展CRISPR/Cas9的能力，从而成功插入和修复基因中的DNA，以达到治疗的目的与效果。Intellia通过不断优化CRISPR/Cas9技术，致力于为患者快速开发出具有针对性的治疗药物。在体内递送这一领域，Intellia尝试利用CRISPR技术治疗甲状腺素运载蛋白淀粉样变性(ATTR)，这是一种罕见且可能危及生命的肝脏疾病。该公司计划在2020年中旬提交其体内候选药物NTLA-2001的IND申请，用于ATTR，并预计在2020下半年进行第一批患者给药。Intellia拥有诺华（Novartis）专有的脂质纳米粒子（LNP）递送技术，并将其作为体内基因编辑的递送载体，NTLA-2001便是基于LNP递送技术将CRISPR/Cas9组合递送到肝脏，实现对肝细胞内的突变甲状腺素运载蛋白（TTR）基因特定DNA实施敲除编辑。Intellia完成了一项为期12个月的LNP制剂持久性研究，证明了LNP技术是一种同样强大而有效的CRISPR/Cas9传递方法，并具有良好安全性和耐受性。LNP几乎是迄今为止所报告的CRISPR/Cas9成分最有效的系统性递送技术，而NTLA-2001也预计将是第一个进入临床的全身给药的在体CRISPR/Cas9疗法。在体外修饰方面，2020年4月1日，Intellia宣布美国FDA已经接受了基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的工程细胞疗法OTQ923治疗镰状细胞病(SCD)的IND（investigational new drug）申请，该申请由其合作伙伴诺华提交，同时也触发了其对Intellia公司的一项里程碑付款。OTQ923是Intellia与诺华合作开发的一种基于CRISPR/Cas9基因组编辑的造血干细胞(HSCs)疗法，用于治疗SCD；通过靶向编辑HSC的DNA，诱导胎儿血红蛋白(HbF)表达，编辑后的细胞返回患者体内，HbF的表达有望减少镰状血红蛋白(HbS)的有害影响。这项1/2期临床试验将在具有严重SCD并发症的成人患者中评估OTQ923。2016年，四川大学华西医院肿瘤学家卢铀教授研究小组率先开展CRISPR/Cas9技术的临床研究（NCT02793856），他们利用该技术敲除了来自肺癌患者T细胞的PD-1，然后再回输到患者体内。该研究在2016年10月28日完成了世界首例CRISPR基因编辑细胞的人体注射，卢铀教授也成为CRISPR基因编辑人体实验的第一人。4月28日，卢铀教授团队在国际顶尖医学期刊 Nature Medicine 上发表了该1期临床试验的结果。研究招募了22名非小细胞肺癌晚期患者，主要终点是安全性和可行性，次要终点是功效，探索性目标包括跟踪基因编辑后的T细胞。研究结果显示，CRISPR/Cas9基因编辑的T细胞的临床应用通常是安全可行的，未来的试验应使用改进的基因编辑方法来提高治疗效果。近年，艾滋病领域的治疗也取得了多项重大进展，让人们更加期待能有更多患者能像“柏林病人”和“伦敦病人”那样得到治愈。中国科学家邓宏魁团队作为20世纪90年代发现CCR5在HIV中重要性的团队之一，表示希望能模仿“柏林病人”。然而CCR5基因突变很少见，实际上在中国不存在这样的突变，于是他们决定尝试编辑该基因。2019年9月12日，北京大学邓宏魁研究组、解放军总医院第五医学中心陈虎研究组、首都医科大学附属北京佑安医院吴昊研究组合作在NEJM(新英格兰医学杂志)上发表了一项研究性论文，该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑成体造血干细胞的CCR5基因，实现了经基因编辑后的成体造血干细胞在人体内长期稳定的造血系统重建，然后对一个患艾滋病和急性淋巴细胞白血病的27岁男性进行治疗。治疗后病人的急性淋巴白血病达到形态上的完全缓解，病人的T细胞呈现一定程度上对HIV病毒的抵抗能力，且未发现脱靶效应和副作用。这项基因编辑是在成体造血干细胞上进行的，因此并不会对其他组织器官及生殖系统产生影响。该工作初步证明了基因编辑的成体造血干细胞移植的可行性和在人体内的可行性和安全性。
>>>> 宾夕法尼亚大学Carl June教授团队
美国宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）的研究团队在2019年4月开启了应用基于CRISPR技术改造过的T细胞疗法（NYCE T细胞疗法）治疗癌症（多发性骨髓瘤和肉瘤）的人体临床试验，并于2019年11月6日在美国血液学学会（ASH）会议公布了一份研究摘要，这也是该研究第一个临床试验的早期数据。
▲ Carl June
这款NYCE T细胞疗法，研究人员从通过抽血收集患者的T细胞开始，然后使用CRISPR/Cas9编辑来敲除三个基因，两个编码内源性T细胞受体（TCR）链的基因TCRα（TRAC）和TCRβ（TRBC），以及编码PD-1的基因（PDCD1），另外，利用慢病毒载体插入一个名为NY-ESO-1的受体基因。
2020年2月6日，美国宾夕法尼亚大学Edward A. Stadtmauer等人在Science上发表的NYCE T细胞在人类I期临床试验的结果，显示了多重CRISPR/Cas9编辑工程改造的T细胞在难治性癌症患者中的安全性和可行性。该研究数据涉及的3名参与者，2名患有难治性晚期骨髓瘤（多发性骨髓瘤），1名患者患有难治性转移性肉瘤，对之前的多种治疗无有效反应。据悉，Stadtmauer团队将陆续在18名癌症患者身上进行试验，预计将会持续到2022年。另外，Carl June博士还将CRISPR技术应用于CAR-T细胞。
CRISPR/Cas技术可用于编辑基因，并在其首次问世时给科学界带来了革命性的变化。现有的包括CRISPR在内的基因编辑技术通过在DNA中产生靶向的双链断裂，然后依靠细胞自身修复机制来完成编辑过程，这种方法可以有效地破坏基因表达。
然而，它们缺乏对编辑结果的控制，脱靶效应以及对DNA双链断裂的依赖，可能导致基因编辑后的细胞出现不可预期的混乱。许多基因组突变发生在单个碱基中，为使基因编辑更加精确，基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术----碱基编辑技术应运而生，碱基编辑器与DNA结合，并精确地将一个核苷酸替换为另一个核苷酸，而不是切割DNA双链，旨在针对这些单一的碱基错误(即点突变)。
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日前（7月31日），基因编辑领域的两大巨头Jennifer Doudna教授和刘如谦（David Liu）教授联手，在《科学》杂志上报道了一种碱基编辑器的首个详细3D结构。这一结构帮助研究者们更深层次的理解碱基编辑器，从而可以制定明智的策略来改良这个系统，还可以设计下一代的碱基编辑器，让它们更好、更适合临床使用。
随着技术的发展，以及对CRISPR系统日益深入的理解与开发，我们期待，这一技术未来能在更广泛的领域造福于人类！
2020年8月22-23日于上海举办2020溶瘤病毒药物开发论坛（Oncolytic Virus Drug Development Forum 2020）。大会将围绕肿瘤治疗前沿技术及溶瘤病毒产品法规解读、 溶瘤病毒产业转化、溶瘤病毒项目经验分享，以及新型溶瘤病毒的发展及资本支持四个主题，专项技术深耕挖掘，为行业带来前所未有的深度技术交流及成功经验分享。
参考资料：
1.https://phys.org/news/2020-07-mechanisms-largest-crispr.html
2.https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1097276520304743?via%3Dihub
3.https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190821.1004.004.html
4.https://news.berkeley.edu/2020/07/30/new-understanding-of-crispr-cas9-tool-could-improve-gene-editing/
5.“Crispr puts first human in-body gene editing to test” from https://www.ft.com/content/0fbf0604-1df5-11ea-97df-cc63de1d73f4