基于iPSC治疗心脏疾病研究的大阪大学教授成功利用AAV完成CRISPR基因编辑递送，实现成熟心肌组织的精准靶向整合丨医麦猛爆料

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2020年9月23日/医麦客新闻 eMedClub News/--近日（9月18日），日本大阪大学医学院的科学团队在Scientific Reports上发表了一篇研究性论文，首次证明了腺相关病毒（AAV）介导的基因传递可在小鼠成熟心脏组织和从hiPSCs分化来的人心肌细胞（hiPSC-CMs）中促进精准的靶向整合，并且与DNA合成无关。

一直致力于基于iPSC治疗心脏疾病研究的大阪大学心血管外科泽芳树(Yoshiki Sawa)教授也参与了该项研究。

我们知道，CRISPR基因编辑介导DNA双链断裂（DSB）后，该缺口通常可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径修复。NHEJ主要在于断裂 DNA 直接连接，HDR主要在于细胞依据 DNA 模板进行同源重组修复。因此，NHEJ是一个容易出错的过程，会在DSB位点形成插入或缺失，而HDR则可以使用单链或双链DNA模板进行准确的基因组修复。

尽管到目前为止，通过NHEJ修复的CRISPR / Cas9介导的靶向基因破坏在鼠成年心脏组织中是有效的，但尚未报道HDR介导的成年心脏心肌细胞中靶向基因组的置换。 并且，在不分裂的心肌细胞中靶向整合的潜在机制仍有待阐明。

而由于HDR主要发生在S/G2期，基因组编辑后基于HDR的修复过程局限于积极分裂的细胞，因此限制了其应用于由停止增殖的非分裂型心肌细胞组成的成熟心脏。一直以来，有丝分裂后（post-mitotic）心肌细胞被认为是无法进行包括CRISPR/Cas9基因组编辑后的HDR在内的精确靶向整合的。

此前，研究人员的发现已初步表明，AAV介导的基因传递能在尚未进入S期（不依赖DNA合成）的小鼠心肌细胞中促进HDR进行靶向基因组置换，但这些观察结果局限性在于使用的是新生小鼠心肌细胞。 

在这项研究中，研究人员证明，通过脑室内注射AAV直接递送大量转基因编码的gRNA和修复模板DNA，可以促进表达Cas9的成年鼠心肌细胞中的精准靶向基因组替换，而全身注射AAV或直接注射腺病毒（AdV）都不会促进其靶向整合，表明心肌细胞中需要高拷贝数的单链转基因。并且，在进入S期的心肌细胞中，AdV转导促进的靶向整合是有限的，而AAV介导的基因传递促进靶向整合，并与S期进入无关，这表明AAV介导的基因传递是促进非分裂心肌细胞靶向整合的关键决定因素。

另外值得注意的是，在体外和体内，AAV介导的心肌细胞靶向整合依赖于范可尼贫血通路（Fanconi anemia pathway，FA通路），这是单链模板修复机制的关键组成部分。

最后，由于在分化的、收缩的人类心肌细胞中替换目标基因组的直接方法可能会提供多种分析应用。对此，研究人员使用2D单层方法将由心肌病患者生成的hiPSC分化成心肌细胞，即hiPSC-CMs。研究结果表明，AAV2介导的基因传递与Cas9的瞬时转染相结合，促进了人单层hiPSC-CMs中的靶向整合（与DNA合成无关），并且能直接观察到单层跳动的心肌细胞中的肌结收缩。

总之，这项研究揭示了AAV介导的基因传递在促进心肌细胞的精准整合中的重要作用，并为非分裂心肌细胞中靶向基因组置换提供了广泛应用。

AAV基因治疗，前景挑战并存

腺相关病毒（AAV）最早是在20世纪60年代中期从实验室腺病毒(AdV)制剂中发现的，并且很快就在人体组织中发现。AAV具有无致病性、高效的长期基因表达、易于基因操作以及免疫反应低(或在许多情况下缺乏)的特点，这一系列特性使其成为基因递送的重要工具。

而近10年来，全球的基因治疗领域也迎来了空前的发展，世界范围内先后批准了10多款基因治疗产品上市。其中有三款以重组AAV为载体的基因治疗药物，它们是UniQure公司开发的Glybera（AAV1），SparkTherapeutics公司开发的Luxturna（AAV2）和诺华公司开发的Zolgensma（AAV9）。由此，我们可以看出AAV 基因疗法的潜力是巨大的，同时也是有着成功经验的。

AAV载体介导的基因传递不仅被批准用于治疗遗传性失明和脊髓性肌萎缩症(SMA)，还在其他罕见疾病，包括血友病和杜兴氏肌营养不良症（DMD）中取得了长期的治疗效果。目前已经从人和猴体内分离出 12 种腺相关病毒血清型，大部分已经应用于临床开发，而每种血清型不同的组织嗜性共同构成了AAV载体相对丰富的组织特异性。在众多血清型的AAV载体中，基于AAV2的基因递送平台相对来说是最多的，但是诸如AAV8，AAV9和AAVrh.10等新一代衣壳也正在临床试验中得到更多应用。

▲不同AAV血清型的特性和及临床应用

（图片来源：Nature Reviews Genetics）

基于目前越来越多的AAV相关基因疗法候选产品进入临床开发，以及越来越严格和完善的监管制度，行业在产业转化过程中面临的AAV载体大规模生产工艺和合规性挑战也越来越凸显；并且AAV制造过程复杂，限制因素较多，行业相关专业服务商的赋能显然必不可少。

比如，相比于由贴壁培养过渡到放大规模的悬浮培养，尽早使用悬浮培养生产病毒载体的策略，有望大大简化工业化的大规模生产。而值得注意的是，大规模生产工艺是保证高产量和可靠的AAV病毒载体商业化制造过程的关键，这依赖于稳健的大规模瞬时转染过程。对此，专业且富有实战经验的转染试剂供应商可以为高效稳健的转染过程提供重要支持。

Polyplus-transfection是第一家面向基因和细胞治疗市场的GMP转染试剂供应商，也是唯一一家从最初的工艺开发到商业化向病毒制造商提供广泛的技术和监管支持的转染试剂供应商。2018年，该公司推出了首个用于生产治疗性病毒的GMP兼容转染试剂（PEIpro®-GMP）。

该公司近期还推出了一款基于化学成分且不含动物源的阳离子纳米技术的转染试剂FectoVIR®-AAV，专为悬浮细胞体系规模化生产AAV而开发，可用在基因和细胞治疗领域。

FectoVIR®-AAV适用于各种规格的摇瓶、转瓶、细胞培养袋和生物反应器中无血清悬浮培养的DNA转染，且兼容在细胞培养过程中抗生素的使用。对比其他转染试剂，FectoVIR®-AAV具有显著的优势，并可以解决现有转染试剂在AAV生产过程中的局限性。

产品特性：

• 更高的产量：与PEIpro®比，AAV产量可增加2-3倍

• 复合物稳定性好: 可延长至6小时

• 工作体积减小：由10%减至1%

• DNA用量减少: 可减少25%

• 灵活性: 兼容商业化细胞培养基

• FectoVIR®-AAV：严格的生产和质控标准

• GMP级产品：即将于2021年6月上市

订购信息

可根据需求定制更大规格的包装。

对FectoVIR®-AAV转染试剂有意者请联系：

刘海芹：Polyplus商务经理，13761803975（可加微信）

邮箱：[e-mail]

关于Polyplus-transfection^®

作为一家专业的转染试剂研发和生产公司，Polyplus-transfection®拥有近20年的转染经验，所开发的转染试剂可满足处于各个阶段的客户，从初期的工艺流程开发，到临床前研究以及临床试验以及商业化。其开发的用于基因治疗和细胞治疗领域的病毒载体生产试剂PEIpro®系列产品已经越来越广泛的应用到了众多的临床试验中并成为了行业的金标准。

参考资料：

1.https://www.nature.com/articles/s41598-020-72216-y

2.Nature Reviews Genetics

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