24小时完成CAR-T细胞产品制备，有多少种方法可供选择？
2022年5月16日/医麦客--星耀研究院新闻 PharmaBIGStar News/--CAR-T等细胞疗法产品的研发如火如荼，引发产业化逐渐兴起。许多企业在GMP化过程中，利用生物技术的“迭代”更新，不断将生产的量和质推向新的高度。然而，也遇到了一些问题，如CAR-T生产具有“个体化”特点，一人一剂，要调动整个临床诊疗和生产链的各个环节，通常需要2~6周，消耗大量时间；CAR-NK生产中，自体提供的NK细胞数量少，需要2-3周进行扩增培养，并且需要完全清楚其中混杂的T细胞，以防止移植物抗宿主病(GvHD)。一些细胞疗法布局药研机构在缩短制备时间的方向上深耕，孵化出多种方法。
国内外细胞疗法缩短制备时间的关键点和研发思路
以开发较为成熟的CAR-T治疗产品为例，制备各环节就包括最初分离和富集T细胞、T细胞活化、使用病毒或非病毒载体系统进行CAR基因转移、体外CAR-T细胞扩增，以及最后的末端工艺和冷冻保存等，即体外对T细胞修饰改造过程，花费了大量时间。如此一来，可能会出现在这一时间疾病进展、污染、T细胞健康等问题。因此，如何减少细胞治疗产品的体外部分生产的环节生产时间至关重要。那么如何才能缩减这部分时间呢？
提高载体转导效率
熟悉CAR-T产品对于载体的价值都知道，为了将目的基因转导入T细胞，需要利用慢病毒载体等在CRISPR/Cas9等基因编辑技术的作用下才能将CAR(嵌合抗原受体)转导入T细胞，如果提高载体转导效率，使T细胞活性提高等，那么缩短制备时间是有可能的。
高基因转导效率的XLenti载体
亘喜生物拥有FasTCAR技术平台，能够使用来自慢病毒，具有高质量、表现出高基因转导效率的XLenti载体，同时激活和转导处于静息状态的T细胞。在转导后，一种或多种CAR会整合到T细胞基因组中并稳定表达。公司的临床前研究表明，经过转导的T细胞具有较高的扩增和肿瘤细胞清除活性，去除了体外细胞扩增步骤的必要性，可直接成剂并给患者使用。也就是说，FasTCAR技术能将激活、转导和扩展步骤转化为一个单一的“并行激活-转导”步骤。如此，展现出多种技术优势。
➤ 缩短生产时间：次日生产完成(22~36小时)，大幅减少患者等待时间。
➤ 提高生产质量：采用全封闭式生产系统设计，降低交叉污染风险，提高操作一致性。
➤ 提高产品可及性：显著降低生产成本，可扩展性高，单一空间中可处理多个样本有望节省医疗卫生系统开支。
➤ T细胞健康度增强：此技术生产的T细胞健康状态表现更好，更年轻且更具活力的CAR-T细胞，扩增性、组织迁移能力及肿瘤清除活性也得到提升。
▲图2 FasTCAR技术生产CAR-T与常规生产时间、流程对比
基于FasTCAR技术平台，亘喜研发出GC012F和GC019F两款CAR-T产品，皆处于临床I期。
➤ GC012F：可同时靶向BCMA和CD19靶点的CAR-T候选产品，能带来快速、深入且持久的治疗效果，帮助MM(多发性骨髓瘤)及B-NHL(B细胞非霍奇金淋巴瘤)患者提高治疗响应率，降低复发率。目前，该候选产品正在中国开展的多项由研究者发起的多中心、I期临床试验中评估其治疗多发性骨髓瘤以及B细胞非霍奇金淋巴瘤的安全性和有效性。在一项针对B-NHL患者评估治疗安全性及耐受性的早期探索性IIT 临床试验中，入组3名患者，中位既往治疗线数达2次。截至2022年2月，3例患者接受了GC012F的单次输注治疗，剂量分别为3.7x104细胞/Kg及2-3x105细胞/Kg。输注后第28天，均达到CR(完全缓解)。在3个月的随访中，2名可评估的患者得到了持续缓解。未观察到剂量限制性毒性及ICANS(免疫效应细胞相关神经毒性综合征)。2名患者出现了1级CRS(细胞因子释放综合征)，1名患者出现3级CRS，未出现4级或5级事件。2021年11月，美国FDA授予GC012F孤儿药资格认定。
➤ GC019F：适用于接受过既往治疗的R/R B-ALL(复发或难治性急性B淋巴细胞白血病)成年患者。患者自身的T细胞经过基因修饰，可以表达CD19特异抗原，靶向并杀伤肿瘤细胞。
推荐阅读：亘喜生物宣布其双靶点FasTCAR-T细胞疗法GC012F治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的首次人体临床试验完成首批患者给药
▲图3 亘喜生物研发管线
表达iRFP的LV载体
2019年，宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院细胞免疫治疗中心Michael Milone团队在美国血液学学会(ASH)会议公布了一份研究结果，宣布其可在短短24小时内产生功能性CD19特异性CAR-T细胞(CART19)。
主要原理源于他们的一个发现，即使用表达iRFP(红外红色荧光蛋白)的LV(慢病毒载体)转导平均6.5％(范围为2％-10％)的新鲜分离的静态T细胞，与活化的T细胞转导相比，表达动力学更慢(静态和活化T细胞分别在96小时和48小时达到峰值)。尽管与活化的T细胞相比效率低得多，但在所有T细胞亚群中检测，其中央记忆T细胞显示出最大的转导效率；与未处理的T细胞相比，平均转导率高4倍。即使没有逆转录或整合酶功能，CAR表达也可以在静态的T细胞中发生，即所谓的“伪转导”。重要的是，宾大团队证明了该表达产生的CAR-T细胞具有溶细胞活性和效应细胞因子，对抗原的反应类似于激活和转导的CAR-T细胞。该研究团队使用公认的急性淋巴母细胞白血病Nalm6模型进行试验，发现由静态T细胞转导16小时后洗涤去除载体产生的CART19细胞表现出剂量依赖性的抗白血病活性，该活性只要注射小剂量即可持久2x105个T细胞。
2022年初，该团队的Michael C. Milone博士和Saba Ghassemi博士等将相关研究成果以Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells为论文名发表在Nature Biomedical Engineering期刊上。
推荐阅读：重磅：突破传统细胞制备工艺，宾大研究团队一日生产出CAR-T细胞丨医麦黑科技
体外维持T细胞干性
Novartis(诺华)的研究基地诺华生物医学研究院(NIBR)近年来开发了下一代CAR-T平台T-Charge平台，能够通过保存T细胞的干性（T细胞自我更新和成熟的能力），从而产生一种具有更高增殖潜能和更少耗竭T细胞的产品。通过使用T-Charge平台，CAR-T细胞的扩增主要发生在患者体内(in-vivo)，无需在体外(ex-vivo)延长培养时间。此技术平台大幅度缩短了CAR-T疗法的生产过程，诺华生物医学研究所总裁Jay Bradner博士表示，只需大约24小时就可以完成疗法的生产。T-Charge平台的这些独特特征，有潜力为患者提供更好、更持久的缓解，改善长期结果，降低严重不良事件的风险。
▲图4 诺华T-Charge平台作用机制
在2021年第63届美国血液学会(ASH)年会上公布了下一代CAR-T平台T-Charge的开发的CAR-T产品YTB323(抗CD19)和PHE885(抗CDMA)正在进行的I期临床试验的早期临床数据。YTB323和PHE885是使用T-Charge平台开发的首批诺华CAR-T细胞疗法。初始疗效数据显示，接受剂量水平2(DL2，12.5×106 CAR+细胞)YTB3231治疗的15例弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者中，第3个月时，完全缓解率(CR)达到了73%(95%CI:44.9,92.2)。同时，接受2种最高剂量PHE885治疗的11例多发性骨髓瘤(MM)患者，最佳总缓解率(ORR)达到了100%。
模拟生物支架
模拟生物支架实际上是在体内做了许多个小型车间，使能够在体内完成T细胞激活、目的基因转导、T细胞扩增等任务，大大缩减了CAR-T制备时间。
MASTER支架
美国北卡罗来纳大学教堂山分校的Yevgeny Brudno研究团队在曾在Nature Biotechnology上发布过一则研究报告。文中表示，研发出MASTER(多功能海藻酸盐支架)，是一种生物指导性可植入式支架，能够在体内快速产生和释放CAR-T细胞，加速了CAR-T产品制备。
MASTER是一种生物相容性的海绵状材料，外观和触感就像一个迷你的棉花糖，可将繁琐耗时的激活、重编程和扩增步骤都在患者体内进行，这就将耗时几周的过程缩短至24小时内。
研究人员从患者身上分离出T细胞，并将这些未激活的幼稚T细胞与工程病毒混合。混合物被倒入MASTER，MASTER将其吸收，生物支架的大孔隙和海绵状特性使病毒和细胞紧密地结合在一起，有利于细胞的基因重组。MASTER上还被修饰了激活T细胞的抗体，因此细胞被激活过程几乎立即开始。植入后，细胞激活过程继续进行，它们开始对修改过的病毒作出反应，这些病毒将它们重新编程为CAR-T细胞。
▲图5 MASTER作用机制
研究人员又对患有淋巴瘤的小鼠进行了实验。一组植入MASTER产生和递送的CAR-T细胞治疗；另一组使用常规制备的CAR-T细胞进行治疗。这两组与接受非工程T细胞的对照组进行比较。治疗结果显示，MASTER治疗组表现得非常好。从幼稚T细胞中制备出用于临床的CAR-T细胞至少需要两周时间；而在分离幼稚T细胞的几个小时内就可以将MASTER引入小鼠体内。研究人员发现，由于细胞在分离后几小时内就被植入，这种最小限度的操作创造了更健康的细胞，这些细胞表现出与CAR-T细胞抗癌疗效差相关的标志物也更少。
具体而言，MASTER技术导致细胞分化程度较低，这意味着会转化为更强和更持久的抗癌能力。此外，这些细胞显示的T细胞衰竭标志物也较少。最终的结果是，通过MASTER接受CAR-T细胞治疗的小鼠在对抗肿瘤方面明显优于接受传统CAR-T细胞治疗的小鼠。在小鼠面临淋巴瘤复发的情况下，抗癌效果的改善在长时间内更为明显。
推荐阅读：数小时完成制备，又一种体内生成CAR-T的新方法丨医麦黑科技
APC-支架
哈佛大学Wyss研究所的David Mooney和SEAS(工程与应用科学学院)的John A. Paulson领导的一个研究小组开发的APC（抗原呈递细胞）-支架，却有望彻底改变CAR-T细胞的扩增现状。相关研究结果于2018年1月15日在线发表权威学术期刊Nature Biotechnology上。
报告认为认为，T细胞激活需要三种信号：(1)T细胞受体(TCR)刺激；(2)共刺激；(3)促生存细胞因子。科学家研发的APC-模拟支架可在体外模仿抗原提呈细胞，发挥了“以一兼三”的功能。为了设计这种模拟APC的支架，研究小组首先在多孔的硅制棒状材料(MSRs)中填入了一种延长相关T细胞存活的APC产生因子-白细胞介素2(IL-2)。然后用类似于APC的细胞外膜，磷脂双层膜(SLB)包被MSR。接着，研究人员用一对T细胞刺激抗体进行功能化(这些抗体能够在脂质层中保持移动并且能与T细胞表面的受体/共受体分子结合)。最后，在培养基中，通过棒状材料的沉降和随机堆叠，三维支架自发形成，并形成足够大的孔，允许T细胞的自由进入、移动和积累，从而发出刺激其成倍扩增的信号。
▲图6 APC-模拟支架结构
在一系列的并行比较中，Mooney的研究小组证明，APC模拟支架的性能优于商业上可用的扩增珠(Dynabeads，目前用于临床过继细胞治疗)。作为该论文的第二作者，David Zhang表示：“在单剂量下，相比较于Dynabeads，APC-模拟支架使得小鼠和人类的原代T细胞扩增至2-10倍。此外，这种APC模拟支架还有另外一个不容忽视的优势，研究人员甚至可以在所期望的免疫反应中，调整具有不同作用的T细胞亚群的比例，而这在将来可能会增加细胞治疗的有效性。
推荐阅读：Nature重磅：「创意支架」完美呈现CAR-T体外扩增条件，效率可提高10倍丨医麦黑科技
可降解纳米粒技术
西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心的Stephan团队曾在2017年4月于Nature Nanotechnology刊登了一篇文章。文中表示，可利用一种可生物降解的纳米颗粒对人体中的免疫细胞进行重编程，进而转变为CAR-T，而这个过程可在24-48小时内完成。
该纳米颗粒同时包含CAR的表达基因，以及吸引并结合T细胞的分子。一旦T细胞被吸引吞噬掉纳米颗粒后，纳米颗粒中携带的CAR基因就会与细胞中的染色体结合，进而重编程为CAR-T细胞。在24-48h内，T细胞会通过这个过程转化为CAR-T细胞。
在小鼠实验中也取得较为积极的结果，在白血病模型小鼠中输注了这种纳米颗粒，小鼠的白血病获得缓解，平均存活时间延长至少8周以上。值得注意的是，这种方法不需要进行化疗的预处理。
推荐阅读：这绝对是未来基因转导的黑科技：纳米颗粒让CAR-T细胞直接在体内产生
mRNA工程化改造技术
CAR-M(巨噬细胞)与CAR-T相似，都是通过基因工程方法将CAR引入细胞，最终实现肿瘤杀伤。只是一个引入的是巨噬细胞，一个是T细胞。
而MT-101就是是Myeloid公司利用mRNA对单核细胞进行改造产生了新型的CAR-M疗法。血液中的单核细胞在迁移到组织中后大多数会分化成为巨噬细胞。通过在单核细胞表面表达靶向CD5的嵌合抗原受体，MT-101可以靶向吞噬外周组织中的肿瘤细胞。MT-101疗法制造工艺只需一天就能完成CAR单核细胞的制造。
在MT-101相关临床试验中，首例完成给药的患者在接受治疗28天时，未发现剂量限制性毒性，无细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征。
因此，如果将这种思路放在CAR-T等细胞的研发上，不知道会不会也能将制备时间缩短到24小时以内。
此外，除了在缩减细胞治疗产品制备时间上努力深耕外，许多企业也在开发通用型(又名同种异体、现货型)CAR-T、CAR-NK等产品，在解决移植物抗宿主病(Graft versus-host disease，GvHD)和宿主抗移植物反应(Host versus graft reaction，HvGR)等问题的前提下，大大缩短产品的制备时间。国外如Allogene、Cellectics、CRISPR Therapeutics等，国内如亘喜生物、北恒生物、传奇生物、邦耀生物、科济药业、博生吉医药、英百瑞（通用型CAR-NK）等皆在通用型细胞疗法上有所布局。
无论怎样的尝试，相信目的只有一个，就是降低生产细胞治疗产品到患者治疗之间的时间消耗等成本，提高患者可及性，相信会此类产品早一天上市，以治疗处于病痛中的患者。
5月22日，欢迎您 | 共话TIL全产业链条