给基因治疗加上开关-聊一聊Xon系统的来龙去脉

近日，费城儿童医院（CHOP）与诺华生物医学研究所（NIBR）的研究人员在Nature上合作发表了一篇题为“Regulated control of gene therapies by drug-induced splicing”的研究文章。在这个项目中，科研人员把诺华公司的脊髓性肌萎缩症/亨廷顿舞蹈症研究药物Branaplam (LMI070)作为调节剂 ，来微调AAV携带的目的基因在小鼠体内的表达水平。文章发表后，许多基因治疗公众号和网站都对这一研究投以关注并进行报道，小编也想和大家聊一聊这个X^on系统的来龙去脉。

一． 关键的调控药物Branaplam (LMI070)

Branaplam (LMI070) 是一种可以口服的小分子 RNA 剪接调节剂。诺华开发该药物的初衷是想将其作为脊髓性肌萎缩症（SMA）的潜在疗法来使用。然而，由于自 2016 年以来 SMA 治疗领域的快速发展， Branaplam (LMI070) 已经不再是SMA 患者治疗的最优选择，因此诺华决定在 2021 年停止将branaplam 作为 SMA 疗法的研究工作，同时为它寻找治疗亨廷顿病的临床路径（2020年10 月21日，FDA已授予 Branaplam治疗亨廷顿舞蹈症的孤儿药认定）。为了理解Branaplam (LMI070) 在这个开关系统中的作用，小编先带大家补充一下两段背景知识，即RNA选择性剪接与脊髓性肌萎缩症。

RNA选择性剪接

基因转录的初始产物是未成熟的前体 mRNA，其中包含散布在编码了外显子序列之间的非编码的内含子序列。mRNA 的成熟需要其在翻译成蛋白质之前去除内含子序列并将相邻的外显子剪接在一起。这个过程被称为组成型剪接，它会发生在每个内含子-外显子的边界上。在 1970 年代末和 80 年代初，几个研究小组意外地发现，有多个不同的成熟mRNA竟然由同一基因转录而成。对于这一现象最合理的解释是，存在一个未知的前体 mRNA 加工步骤，其功能是切除特定的外显子并将非相邻的外显子剪接在一起。这个过程，被称为选择性剪接，是一种重要的进化保守机制，它可以在有限的基因组中增加蛋白质组的复杂性。组成型剪接依赖于外显子边界的识别，并由剪接体复合物控制。剪接体由 150 多种蛋白质组成，此外还有五种具有催化功能的small-nuclear ribonucleoproteins (snRNPs)  U1、U2、U4、U5 和 U6。前体 mRNA 中的分支点序列以及 5' 和 3' 剪接位点splice sites-ss（分别为 5'SS 和 3'SS）是剪接体识别和组装所需的核心序列，他们会确保剪接体组装正确发生。其中分支点序列位于 3'SS 上游 18-40 个核苷酸处，然后是一段polypyrimidine tract。剪接的组装通过一系列反应发生，首先是 U1 snRNP 识别 5'SS，从而产生早期复合物。随后通过将 U2 snRNP 识别到分支点序列上来形成剪接前复合体。最后一步是通过tri-snRNP U4/U6-U5的募集和交换来完成，以通过酯交换反应切除内含子并连接剩余的外显子序列。

Fig.1 mRNA组成型和选择性剪接的调节

选择性剪接反应的发生方式类似于组成型剪接，然而，有几个因素会直接影响剪接位点的选择。选择性剪接的外显子通常具有较弱的剪接位点，即与共有保守序列相比，它会含有个别的突变碱基。因此与组成型外显子不同的是，剪接体不能很好地识别选择性剪接外显子上的剪接位点。此外，前体mRNA 固有的其他序列（顺式调节元件）会以序列特异性的方式招募RNA 结合蛋白 (RBP) 和剪接因子这样的反式作用因子。如果RBP与内含子或外显子中的剪接增强motif结合，则可以稳定剪接体的形成并促进外显子的识别和保留。相反地，如果另一些RBP与内含子或外显子中的剪接沉默motif结合，则可以防止剪接体形成并促进外显子的跳读。虽然可变剪接形式的生理学意义目前仍未得到充分研究，但众所周知，当可变剪接被错误调节时，会导致严重的人类疾病，例如接下来要讲的脊髓性肌萎缩症。

脊髓性肌萎缩症（Spinal muscular atrophy，SMA） 

SMA 是一种遗传性疾病，在严重的情况下，患者会在出生后的两年内死亡。SMA 的基本发病机制是由于SMN蛋白缺乏导致脊髓中的 α 运动神经元死亡。人类有两个 SMN 基因，SMN1和SMN2，它们都可以表达产生 SMN 蛋白。全长 SMN (FL-SMN) 蛋白主要是SMN1基因的产物。大约有 95% 的 SMA 病例要归因于SMN1基因的纯合缺失，以至于导致SMN蛋白表达过低。SMN2基因之所以仅仅可以抵消一小部分损失的SMN1，是由于SMN2基因exon 7上+6 位 (C6T)的胞嘧啶突变成了胸腺嘧啶，从而导致exon 7在可变剪接后被排除在了成熟mRNA之外，以至于SMN2基因表达出的SMN蛋白较短且不具备完整的功能。从本质上来说，SMN2基因exon 7中的 C6T 突变，导致这短序列形成了一种新的 Exonic splicing silencer，它可促进与剪接抑制因子Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein-A1 (HNRNPA1) 的结合。HNRNPA1 与SMN2 exon 7 中Exonic splicing silencer 的结合阻止了 U2 snRNP 复合物的正确形成并促进了exon 7的切除。因此，目前治疗 SMA 的策略就是是靶向SMN2 exon 7的反式剪接激活因子和抑制因子。

Fig 2. SMN2的剪切机制与LMI070的作用

Branaplam (LMI070)的功能

诺华的Branaplan就是基于这一治疗策略的小分子药物，它的作用机制是通过与 RNA 的序列选择性结合（这一序列小编会在下一段中提及）来促进dsRNA 结构的稳定（U1 spliceosomal RNA与SMN2 mRNA）。在Branaplan的存在下，U1 snRNP 复合物对SMN2 exon 7的 5'SS 的亲和力增强，这最终促进了SMN2 exon 7的成功剪接和全长 SMN 蛋白的表达。诺华的研究人员在 SMA 小鼠模型中对其进行了测试，发现SMN 蛋白的数量明显增加，从而改善了动物的体重和存活率。   

Fig 3. Branaplam (LMI070) 作用机制的示意图

二． 将小分子控制的RNA的可变剪接用于蛋白表达开关-X^on system

在“Regulated control of gene therapies by drug-induced splicing”这篇文章中，作者开发了一种名为X^on的蛋白表达调控系统。首先，作者将修饰后的SMN2 minigene（原始SMN2 minigene在 Exon 7 受体剪接位点被进行了修饰，以减少天然条件下大约 10% 的背景剪接）作为第一个剪接开关。这样在没有添加药物的情况下，SMN2 的Exon 7会发生外显子跳读，并导致Exon 8表达过早终止，从而使位于Exon 8下游的目的基因无法表达；但在存在药物的情况下，Exon 7则会被正常剪接，进而使处于Exon 7、Exon 8同一读码框内的目的基因正常表达。体外实验结果证明，在LMI070浓度大于 1 μM 时，SMN2 minigene的Exon 7被完全剪接到成熟的mRNA当中，处于同一读码框的目的基因表达量大约达到本底水平的20 倍左右。

由于Branaplan的作用原理，是其能与 U1 snRNA 和Intron 7的5'ss 所形成的 dsRNA 大沟相结合，进而稳定 U1 snRNP 与 Intron 7的相互作用，于是避免了Exon 7的外显子跳读。因此Branaplan其实是一个广谱性的药物，它不仅能促进SMN2 基因的正确剪接，在整个基因组上，它还能促进许多潜在靶点的剪接。由于调控SMN2 minigene 基因表达开关所需的Branaplan 量较大，这样的剂量很难转化成临床应用，因此作者就把目光放在了Branaplan 的其他潜在靶点上。 通过体外细胞给药加RNAseq，作者筛选到了多个可被 Branaplan 促进剪接的基因，例如SF3B3、BECN1、C12orf4和PDXDC2。这些候选基因得外显子共享一个强 3' AGAGUA motif，该motif与鉴定的 LMI070 靶向 U1 RNA 结合位一致（外显子3’ motif AGAGUA，U1 RNA AUACUUACCUG， 内含子 motif GUAAGUCU ）。接下来作者用SF3B3、BECN1、C12orf4和PDXDC2 的minimal intronic intervening 序列，构建了一系列可由Branaplan 操控的外显子剪接原件，并用荧光素酶作为reporter来观察该元件的对目的基因表达的开启与关闭。为了限制目的基因的翻译泄露，调控外显子仅包含 Kozak 序列和 AUG 起始密码子，其他所有可能的下游起始密码子都被突变掉了。这样在不加入Branaplan 时，由于调控外显子被跳读，导致整个读码框不再含有起始密码子，因此外显子1-外显子2与目的基因都无法表达；但在加入Branaplan 后，带有ATG的调控外显子被剪接到成熟mRNA中，ATG下游串联的调控外显子-外显子2与目的基因都可以正常表达。在体外实验中，每组转染了外显子剪接原件的 HEK293 细胞，在加入Branaplan后都开启了荧光素酶的表达。其中SF3B3-on 开关表现出大于 100 倍的诱导能力，这比 indSMN2 minigene所能提供的诱导能力还高了5 倍。

                     Fig 4. 基于SMN2与 SF3B3 的X^on系统 

在接下来的实验中，研究人员将X^on系统整合在了AAV中，并利用Branaplan 来调控AAV携带的外源基因在小鼠体内的诱导表达。例如他们在小鼠中使用X^on系统来调节促红细胞生成素（EPO）的水平，并以此治疗与肾脏疾病相关的贫血病症。研究人员发现，根据不同的给药剂量，他们可以使红细胞压积水平比基线水平高出60%至70%。一旦红细胞压积水平缓慢降至基线，该系统可以接受再次给药，并安全地重新诱导EPO的表达，从而达到慢性肾病患者所需的红细胞压积水平。

尽管这篇文章重点关注的是将X^on系统与AAV介导的基因治疗进行联合使用，但研究人员同样指出，改系统也可以被用于CAR-T的细胞治疗领域。在这里，X^on系统可以用来暂停治疗并让T细胞得到充分的休息。作者设计的X^on系统的优势包括整体体积很小，调控药物对患者的副作用少，目的基因可以通过简单摄入口服药物进行多次诱导等优点。 并且X^on不需要像四环素调控系统那样，需要在体内额外持续表达一个repressor，因此它会在需要对目的基因表达进行精细控制的领域有着不错的应用前景。目前CHOP已将这项技术授权给诺华公司，CHOP 和 NIBR 正在合作开发下一代小分子剪接调节剂和 Xon 系统，以实现跨多个临床应用的微调基因调控。

Reference：

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Black A J, Gamarra J R, Giudice J. More than a messenger: Alternative splicing as a therapeutic target[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 2019, 1862(11-12): 194395.

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