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基因治疗载体AAV与固有免疫应答

玖月 细胞基因疗法 2022-12-21

重组腺相关病毒(rAAV)被认为是基因治疗领域最有前景的基因载体。2012-2019年,相继有三款rAAV为载体的基因治疗药物分别被欧洲药品管理局和美国FDA批准上市。然而,在一些动物试验和临床试验中,研究者们发现rAAV载体可以诱导宿主产生免疫反应,从而影响转基因的长期有效表达,甚至产生免疫毒性反应。本文将着重介绍rAAV引起的固有免疫反应,以及采取哪些策略可以降低或避免这些反应的发生。

图1. PRRs对AAV的识别

1. 模式识别受体

固有免疫反应是宿主通过模式识别受体(PRR)识别病原体的独特结构基序——病原相关分子模式(PAMP),进而诱发一系列的信号级联反应产生的。PRR通常在巨噬细胞和树突细胞(DC)等固有免疫细胞上高水平表达,它们可以识别病毒核酸和膜表面糖蛋白成分。根据蛋白质域的同源性,PRR有Toll样受体(TLRs)、cGAS、NOD样受体(NLRs)、C型凝集素受体(CLR)、黑色素瘤缺乏因子2 样受体(ALR)和RIG-1样受体(RLR)等几大类。根据它们的定位,PRR 还可以分为两大类:膜结合受体(如 TLR)和细胞内受体(如 ALR、NLR 和 cGAS)。本文将着重介绍膜结合受体中的Toll样受体和细胞内受体如何识别rAAV感染。

1.1. Toll样受体

Toll样受体(TLRs)是目前研究最广泛的PRR。它是一种跨膜蛋白,包含与PAMP结合的胞外区,以及胞内Toll/IL-1R同源区(TIR)。其中,TLR2 (糖蛋白和脂蛋白)、TLR3 (dsRNA)、TLR4 (糖蛋白和细菌LPS)、TLR7 (ssRNA)、TLR8 (ssRNA)和TLR9 (CpG DNA)被认为与病毒引起的炎症反应相关。

TLR9 可以与存在于细菌和 DNA 病毒基因组中的未甲基化的 CpG序列特异性结合,此过程可能发生在内体运输期间,或者在溶酶体中病毒衣壳发生降解而将基因组暴露时,CpG序列与TLR9结合后活化MyD88分子,进而激活 NF-κB 和干扰素调节因子(IRF7)并诱导 I 型 IFN 和 干扰素刺激基因(ISG)的表达。研究发现,rAAV 在野生型小鼠体内递送的转基因表达会被抑制,但在 TLR9 基因敲除动物中没有。此外,rAAV携带未经修饰的转基因在体内30 天后表达丢失,而当转基因中的CpG被改造时,表达时长超过了90天。

此外,值得注意的是,虽然自互补AAV(scAAV)载体递送转基因的表达更快速且高效,但研究发现它比单链载体(ssAAV)引起了更强的固有免疫反应。通常情况下,针对单链载体的免疫反应是快速且瞬时的。注射后2h内,I型IFN、TLR9、MyD88和TNF-α的RNA水平会小幅度提高,而在6h内消失。相反的,scAAV会诱导这些基因更高水平的表达,同时IL-6、CCL5、MIP-1和TLR2的表达也会升高。细胞因子反应随scAAV载体的剂量变化而变化,而与ssAAV的剂量无关。ScAAV诱导的促炎细胞因子的表达完全依赖于TLR9。将scAAV注射TLR9−/−小鼠则完全没有检测到上述基因RNA转录明显上调,只有TLR2的微弱增加。同样的现象也发生在使用寡脱氧核苷酸(ODN)时,这些分子能够与TLR9强结合且不诱导信号传导,可以用作TLR9的信号阻断剂。当scAAV注射小鼠的同时施用ODN抑制剂,细胞因子反应的抑制效应与TLR9敲除小鼠相似。此外,它还能抑制巨噬细胞、NK细胞和中性粒细胞的浸润,说明这些细胞的招募依赖于TLR9信号诱导的趋化因子。

毫无意外,ssAAV和scAAV在固有免疫和获得性免疫中的差异存在相关性。在相同的剂量下,scAAV比ssAAV诱导了更强的CD8+ T和抗体反应。当注射TLR9−/−小鼠或联合注射ODN抑制剂时,TLR9信号的阻断引起了CTL反应的显著降低,同时,延缓了anti-AAV抗体的生成。这说明,scAAV引起的获得性免疫增强与固有免疫类似,都依赖于TLR9信号。然而,当采用肝脏直接递送FIX时发现,ssAAV和scAAV诱导的适应性免疫反应没有差异,可能与固有免疫信号与转基因表达的时间间隔有关。ScAAV诱导的促炎细胞因子反应主要发生在载体注射后的9h内,而转基因只有在病毒脱衣壳和转录激活后表达,二者存在时间差。与肝脏基因转移相比,骨骼肌内注射scAAV载体能引起对转基因产物的强烈反应。虽然scAAV肝脏基因递送后没有引起抗转基因反应,但抑制TLR9信号能够增强系统性的FIX表达。这意味着NK细胞或者IFN-I活性可能影响了动物模型体内AAV介导的转基因表达的整体水平。

表 1 总结了几种克服 TLR 信号传导的策略。如上所述,通过改造修饰载体基因组中的 CpG来阻止 TLR9 信号传导已被证明可以增强转基因表达并减少肌肉中效应 T 细胞的浸润。

表1. 克服 PRR免疫识别的策略

1.2. 胞内受体

包括识别DNA的cGAS、干扰素诱导蛋白 16(IFI16)和 AIM2,以及识别RNA的RIG-I 样受体(RLR)等。AAV 基因组中含有可能激活细胞质内DNA 识别受体的元件,例如 ITR 发夹结构。具体的激活机制尚不完全清楚,一种假设是衣壳被蛋白酶体降解暴露了 AAV 基因组。另一种可能性是 AAV 感染使得细胞将线粒体 DNA 释放到细胞质中,然后激活细胞质内的受体。克服细胞质 DNA受体识别的策略尚未得到深入探索,因为它们在限制 rAAV 功效方面的作用尚不明确。

细胞溶质 RIG-I 样受体 (RLR) 在几乎所有哺乳动物细胞类型中都有表达,它主要识别异源RNA,该家族的成员包括RIG-I、MDA5 和 LGP2。AAV ITR 具有固有的启动子活性,因此,rAAV 基因组中 5'- 和 3'-ITR 的存在可能导致有义和反义 RNA 的产生,它们可以在细胞质中形成 dsRNA 中间体,这些 dsRNA 分子受到 MDA5 和 RIG-I 的识别,导致产生 IFN-β。在长期 AAV 转导后,还发现 RIG-I 和 MDA5 在灵长类动物视网膜中上调表达。与其他胞内受体一样,RLR 对 rAAV 的影响仍在研究中。在研究丙型肝炎病毒、仙台病毒和 HSV1的感染时发现,它们能够通过增加肝硒蛋白、RNA 解旋酶 SKIV2L 或长链非编码 RNA lncATV 等因子的表达,抑制 RIG-I 的激活。或许阻断AAV中dsRNA引起的免疫反应可以从这些病毒抑制 RLR 激活方法中受到启发。

2. 衣壳免疫和补体系统

图2. AAVs激活补体

尽管衣壳的改变不会影响TLR9相关的固有免疫反应,但是大量的研究证明了针对不同AAV衣壳引起的多种免疫反应。某些特定的AAV亚型,比如AAV1能够转导DC细胞。转导和成熟后的DC细胞将会激活对外源转基因产物的免疫反应。再比如,从恒河猴体内分离出来的AAVrh32.33,用它注射骨骼肌,与AAV8相比,转基因表达水平更低,而抗载体和抗转基因的CD8+T细胞反应更强。这种增强效应依赖于CD4+辅助T细胞,同时与CD40L和CD28共刺激分子有关。

病毒衣壳和补体的相互作用与AAV固有免疫反应有关。免疫沉淀反应显示iC3b可以与AAV衣壳结合,并且,补体与AAV2的结合可以增加巨噬细胞对衣壳的摄取以及合成促炎性细胞因子。补体受体1/2或C3缺陷小鼠与野生型小鼠相比,AAV诱导产生更低的体液免疫水平。此外,AAV不能够激活补体旁路途径。衣壳与H因子结合,抑制因子I介导C3b 降解为 iC3b,这一过程为病毒提供了针对补体的保护效应(图2)。有趣的是,较高剂量的 AAV 可以显著激活补体超过基线水平,而EGTA 可以通过螯合 Ca2+阻断这种反应。这一发现表明 AAV 对补体的激活可能主要依赖于抗体。在人类杜氏肌营养不良症的临床试验中也证明了AAV 激活了补体。一些在试验中接受高剂量rAAV注射的患者体内发现了补体系统的激活,这些患者出现了短暂和/或急性肾功能损害(ClinicalTrials.gov:NCT03362502 和 NCT03368742)。

3. 固有免疫的细胞类型


图3. APC 介导的针对 AAV 载体的免疫反应。A, rAAV 激活 DC 的机制;B, APC 对 rAAV 特异性抗原的呈递。

对 AAV 诱导固有免疫反应的细胞类型的文献报道有限。众所周知,像 cGAS 这样的 PRR 在所有细胞类型中都表达,但在专职抗原呈递细胞 (APC) 中特别丰富。TLR9主要表达于人类的 B 细胞和浆细胞样 DC (pDC)中。专职APC 在 MHC I 类分子介导的AAV 衣壳或转基因抗原呈递中具有重要作用。研究发现,pDCs 和 cDCs 在呈递rAAV时需要协同作用。首先,pDCs 通过 TLR9识别rAAV的核酸并产生大量 IFN-I,以此作为 cDCs 的激活信号,这一过程被称为“DC许可”,cDC细胞对病毒颗粒摄取和加工,然后呈递 AAV 衣壳蛋白启动CD8+ T 细胞的反应(图 3A)。此外,衣壳肽可以通过加载到 MHC II 类分子被呈递给 CD4+ T 细胞(图 3B)。当接受 FIX 基因治疗(rAAV8-FIX) 的患者表现出初始时FIX水平的下降,随后在使用类固醇后又升高时,就发现了这一现象。研究表明,AAV转导肝脏细胞是一种衣壳特异性的CTL反应,衣壳特异性抗原提呈到靶细胞的水平决定了CTL反应的水平。

表2中列出了多种抑制免疫细胞活化的策略。比如,使用细胞类型特异性启动子和 miRNA 介导的脱靶。然而,用于肌肉细胞中特异性表达的启动子在使用时发现在 DC 中存在泄漏表达。另外,在转基因的 3'-UTR 中掺入 miR-142 结合位点,抑制转基因在APCs 的表达从而抑制 CD8+ T 细胞活化。

表2. 针对免疫细胞机制的策略

4. 总结

本文讨论了固有免疫对rAAV 作为基因治疗药物产生的不良影响。尽管安全性是所有基因疗法的主要目标,但这些疗法也可能是诸多罕见病和慢性遗传疾病的唯一治疗选择。因此,这些药物的开发需要我们考虑在挽救生命和相关风险之间取得平衡。在未来的研究中还需要进一步阐明 AAV 引发的固有免疫反应的复杂机制。我们对细节掌握的越多,用于指导改进 AAV 基因治疗的策略就越多。

参考资料:
1. Muhuri M, Maeda Y, Ma H, Ram S, Fitzgerald KA, Tai PW, Gao G. Overcoming
innate immune barriers that impede AAV gene therapy vectors. J Clin Invest. 2021
Jan 4;131(1):e143780. doi: 10.1172/JCI143780.
2.Rogers GL, Martino AT, Aslanidi GV, Jayandharan GR, Srivastava A, Herzog RW. Innate Immune Responses to AAV Vectors. Front Microbiol. 2011 Sep 19;2:194. doi: 10.3389/fmicb.2011.00194. 

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