siRNA疗法在肺癌治疗中的研究进展
来源
《中国新药与临床杂志》, 2023年1月，第42卷第1期
作者
王兆，高壬驰，陈潼，孟兰迪杨，杨磊，石毅，刘红梅，蔡璐璐，蒋灵晰
四川省医学科学院·四川省人民医院/电子科技大学附属医院 个体化药物治疗四川省重点实验室，人类疾病基因研究四川省重点实验室
摘要
关键词
RNA，小分子干扰；癌，非小细胞肺；信号通路，药物靶点
正文 |
根据世界卫生组织（WHO）的数据，2020年肺癌的报道病例超过200万，其中非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最广受关注的一类，五年生存率不到1/5，常规的治疗手段被认为局限性巨大[1]。小干扰RNA（siRNA）疗法则是一种新型治疗方案，常利用特定载体递送特异siRNA与目的基因的mRNA片段结合，达到基因沉默的目的。近年的研究提示siRNA疗法在NSCLC治疗中具有巨大潜力，不仅增加成药的靶点数量，还更高效地降低了NSCLC细胞的活性[2, 3]。同时更多研究[4, 5]证实，明确特异靶点抑制肺癌的机制、选择合适且特异的载体均是siRNA疗法在肺癌中成功的关键。本文总结了不同基因靶点选择在抑制肺癌细胞增殖、促进肺癌细胞凋亡、抑制转移以及逆转多药耐药性等方面用于肺癌治疗的作用机制，简单介绍了目前siRNA药物的递送策略，并分析了siRNA疗法的优势所在，以期推动siRNA疗法用于肺癌治疗的临床转化。
siRNA疗法在肺癌中特异靶点的选择
1 促进肺癌细胞凋亡、抑制生长的靶点
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是细胞生长、增殖和存活的关键因子，能够促进癌症发生与发展，因此其相关信号通路也被认为是突破传统药物最重要的信号通路之一。目前临床中mTOR抑制剂雷帕霉素已被用于癌症治疗，但容易对正常细胞产生多种不良影响。利用siRNA疗法靶向特定基因的优势，开发一种mTOR基因靶向抑制剂是替代化疗药物雷帕霉素的更优选。
MATSUBARA等[6]采用一种直接特异性抑制mTOR的siRNA（mTOR-siRNA）作用在RERF-LC-AI肺癌细胞上，发现经mTOR-siRNA转染治疗后，mTOR基因表达降低了42.5%，可诱使肺癌细胞的数量显著减少37.3%，细胞凋亡水平增加了16.7%。GANDHI等[7]也发现mTOR-siRNA敲低A549肺癌细胞中70%的mTOR蛋白表达后，A549肺癌细胞活力降低了36%。此外，siRNA对mTOR基因的沉默还导致其下游靶标p70S6K、eIF4E和4EBP1的磷酸化分别下降了69%、62%和58%[8]。以上研究均提示了mTOR-siRNA介导的mTOR基因低表达，能够通过抑制增殖和促进凋亡来有效控制肺癌细胞的生长，且siRNA疗法可以有效避免雷帕霉素治疗引起的非感染性肺炎，在治疗应用方面比传统药物具有更大的优势，是一种安全高效的肺癌治疗策略。
除了直接抑制mTOR表达，还可以对mTOR信号通路上游蛋白进行干扰，从而促进细胞的凋亡。例如跨膜4L六家族成员5蛋白（TM4SF1）是一种小的质膜糖蛋白，介导肿瘤的增殖和转移，是被重点研究的mTOR信号通路上游的siRNA疗法靶点之一。YE等[9]使用siRNA药物靶向沉默A549和H1299细胞系的TM4SF1，发现TM4SF1-siRNA处理后不仅将大量细胞阻滞在细胞周期的G2期使得细胞增殖能力下降约50%，还可以改善肿瘤细胞耐药性，使得A549和H1299两种肺癌细胞系对顺铂和紫杉醇药物敏感性分别增加70%和50%。磷酸酶张力蛋白同系物（PTEN）[10]是促进肺癌细胞凋亡的重要靶点，而三方基序蛋白（TRIM25）[11]会抑制PTEN的这种作用。因此TRIM25就成为了mTOR信号通路上游的另一核心靶点。HE等[11]利用siRNA下调A549和H1299两种肺癌细胞系中的TRIM25表达，恢复PTEN的活性，成功将肺癌细胞活力下调为对照组的40%和37%。同时，将敲低后的细胞接种于裸鼠中，18d后肿瘤体积仅为对照组的25%，有效抑制了肺癌的发展。该实验结果证明，以TRIM25为靶点的siRNA疗法则可以对核心蛋白的上游进行顶端控制，来改变核心蛋白的生物化学过程，促进凋亡。
本研究发现除mTOR信号通路靶点之外，还有其他的信号靶点也被证实可抑制肺癌细胞增殖和促进肺癌细胞凋亡，比如敲低后通过阻滞细胞周期而抑制肺癌细胞增殖的POLO样激酶1（PLK1）[12]和L型氨基酸转运蛋白1（LAT1）[13]；还有敲低后通过改变细胞生命活动调控点的核心蛋白因子BCL2/BAX/BIM促进肺癌细胞凋亡的存活蛋白（SURVIVIN）[14]、GINS复合体亚基2（GINS2）[15]和癌睾丸抗原家族45成员A1（CT45A1）[16]。作用于以上肺癌细胞靶点的siRNA药物对肺癌细胞的抑制率被报道比传统药物高出40%到75%不等。
2 逆转肺癌多药耐药性的靶点
肺癌治疗中存在严重的多药耐药性问题，以临床上常采用表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的治疗[17]为例，由于部分患者具有EGFR（T790M和C797S）基因突变，使得约60%的患者出现TKI耐药[18]，严重延误治疗进程。而siRNA疗法研究显示，通过抑制相关核心通路激活可使肺癌细胞对EGFR-TKI重新敏感，是一种十分有效的治疗策略。既可辅助治疗的推进，对传统疗法也是一个有效补充。
PI3K/Akt/mTOR、RAF-MEK-ERK、JAK/STAT3和Hippo信号通路的异常激活均被认为是TKI耐药性出现的重要原因，研究显示上诉四种信号通路异常激活往往与TKI使用后一些上游蛋白如丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶1（STYK1）、胰岛素受体底物（IRS）Yes相关蛋白（YAP）的表达量显著增加有关。而利用siRNA疗法可有效敲低这些蛋白的异常表达进而逆转肿瘤耐药性。STYK1是一种酪氨酸激酶，过表达后可通过PI3K/Akt/mTOR、MAPK、JAK/STAT3通路促进侵袭和转移来增强肿瘤进展[19]。EGGERMONT等[19]对使用了第三代TKI药物处理后的H1975、HCC827和PC9肺癌细胞系进行STYK1-siRNA靶向敲除STYK1后，发现三种细胞对TKI药物敏感性增加了62%，有效逆转了肺癌细胞的耐药性。IRS是一种细胞质衔接蛋白，该蛋白表达增加可激活PI3K/Akt和Ras-MAPK信号通路[20]，从而调节细胞生长、增殖、代谢和存活，诱发肿瘤细胞的耐药性增强。而HAO等[21]的研究发现，通过靶向敲低A549细胞系中过表达的IRS基因可以抑制约79%的肺癌细胞增殖，同时还削弱了75%的肺癌细胞对EGFR-TKI的耐药性。YAP蛋白是Hippo通路中的主要介质之一，NSCLC细胞在使用TKI治疗后，会激活YAP和下游酪氨酸激酶受体效应器受体酪氨酸激酶（AXL）表达[22]，进而通过一种不依赖EGFR的旁路信号传导机制激活下游信号传导以促进肿瘤增殖。HUANG等[23]通过使用YAP-siRNA敲低YAP表达可以恢复PC9细胞系对EGFR-TKI药物60%的敏感性，并通过抑制EGFR和旁路信号通路实现促进肿瘤细胞凋亡。
临床上常发现对具有KRAS基因突变者使用TKI治疗可能会迅速促进肿瘤细胞的生长和扩散[24]。而针对该靶点已经有临床试验正在进行，这也是如今唯一一项针对肺癌患者的siRNA疗法临床试验。2019年1月，Nitto BioPharma公司开始研究名为NBF-006的siRNA药物用于具有KRAS基因突变的NSCLC患者的临床治疗。尽管该研究仍在进行中，但是针对该靶点的临床前研究已显示出良好的效果[24]。NSCLC中还有许多其他的致病突变，已有多项基础研究基于siRNA可以靶向许多位点的特性，将这些突变位点作为靶点研发siRNA疗法，并取得了不斐的成绩[6, 19]。因此，siRNA疗法或许在不久的将来会有更多的临床试验，对NSCLC的临床治疗起到强有力的推进作用。
总体而言，siRNA疗法可以创新性地运用基因工程技术做到特异高效地降低肺癌细胞对药物的耐药性，还可以减少副作用[25]、降低细胞毒性[26]，因此siRNA疗法的开发对于耐药患者是一种福音。除上述选择外，还可以通过干扰一些靶点增加肺癌细胞对化疗药物顺铂和紫杉醇等的敏感性，例如干扰拓扑异构酶β结合蛋白1（TOPBP1）[27]可以通过上调p53增加肺癌细胞对顺铂药物约50%的敏感性，干扰类泛素修饰分子4（SUMO4）[28]可以通过抑制JAK2/STAT3通路上调肺癌细胞对顺铂约32%的敏感性，除此之外含杆状病毒IAP重复蛋白6（BIRC6）[29]和有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（MAD2）[30]等也是逆转肺癌细胞耐药性的有效靶点。
3 抑制肺癌转移的靶点
钙黏蛋白家族的改变会显著影响细胞间接触的黏附性，E-cadherin蛋白表达降低、N-cadherin蛋白和基质金属蛋白酶（MMP）家族蛋白表达增加都会降低细胞间的黏附作用，有利于细胞的转移。
传统的治疗手段因其广谱性，难以区分判别肺癌细胞转移发生途径，因此抑制癌细胞转移的药物较少，而利用siRNA疗法可以通过对肺癌转移相应靶点的遏制来抑制肺癌的转移。虽然抑制肿瘤中的钙连蛋白家族还有MMP家族均可直接减少恶性肺癌的侵袭和淋巴结转移[31]，但是对该类广泛表达的基因进行干扰并非siRNA靶点性治疗的初衷。而低保真度的DNA聚合酶Y家族的DNA聚合酶（POLI）引导DNA复制相关蛋白跨跃损伤DNA片段，完成基因组的复制过程。但是该蛋白的过表达会进一步加速肿瘤细胞发生DNA损伤，并且在肺癌中，POLI基因的过度表达与肺癌患者较差的预后显著相关，是肺癌中的特异靶点。LI等[32]在此基础上构建了POLI基因siRNA，可在肺癌细胞A549中特异性引起E-cadherin蛋白的降低和N-cadherin、MMP2和MMP9蛋白的增加，降低恶性细胞40%迁移能力与50%侵袭能力。因此，有关POLI的siRNA疗法抗肺癌转移效果较为理想。
除该类蛋白质外，包括人类抗原蛋白和Nanog蛋白[25]在内的其他蛋白也是导致肿瘤转移的核心靶点，可以通过下调N-cadherin蛋白、MMP2和MMP9蛋白降低肺癌细胞约70%的转移侵袭能力。此外，血管生长因子相关的靶点等也是高效抑制肺癌转移的靶点。
4 促进肺癌免疫应答的靶点
程序性死亡受体配体1（PD-L1）是一种与肿瘤进展相关的细胞膜蛋白，临床研究结果[33]已证明，肺癌细胞中的PD-L1蛋白使这些细胞对T细胞诱导的裂解不敏感，从而增强了肿瘤发生和侵袭性。阻断PD-L1与程序性死亡受体1（PD-1）相互作用，可有效抑制PD-1/PD-L1信号通路的激活，逆转T细胞耗竭，避免肿瘤的免疫逃逸，是NSCLC治疗指南中最为推荐的一种免疫检查点抑制剂。
LIU等[34]设计了靶向PD-L1的siRNA药物，高效敲低HCC827细胞中PD-L1表达同时，也使得HCC827细胞活力降低70%，可有效抑制肺癌细胞的生长。同时，由于EGFR可以通过NSCLC细胞中的PI3K/Akt和JAK/STAT通路上调PD-L1表达，针对EGFR的药物也显示出逆转肿瘤免疫逃逸的效果[35]。此外，干扰素（INF）-γ和EML4-ALK[36]信号也被称为NSCLC中的PD-L1诱导剂，针对这些靶点的药物也值得进一步研究。因此，siRNA疗法的双重效果加成为靶向免疫检查点药物开拓了道路。
肺癌新药研发竞争日益激烈，寻求新的靶点是突围制胜的关键，siRNA疗法可以从多角度寻找新型药物靶点，对于NCSLC的临床治疗具有十分显著的优势。现将上文所提到的可用于治疗肺癌的靶点总结于下图1。
肺癌siRNA疗法载体的选择
siRNA疗法不仅需要明确靶点基因，载体的选择也至关重要。siRNA药物会被体内存在的核酸裂解酶降解而导致半衰期缩短，而纳米载体有着提高药物稳定性、减缓生物清除或生物降解速率、改变药动学、提高生物利用度等优点，为siRNA药物递送的研发提供了较好的方向。常规的siRNA递送主要依赖于病毒、阳离子聚合物与脂质纳米粒（LNP）等手段。
1 病毒载体
依赖病毒为载体的疗法，正在成为临床干预肺癌疾病的一种新选择。病毒载体如腺病毒、腺相关病毒和慢病毒已申请在临床上运用[37]。病毒载体已被证明在体内基因传递方面十分有效，并具有许多优势，例如能封装和保护敏感化合物、易于生产、成本效益高、能高效表达、易于外部修饰和有天然生物相容性等[38]。有研究[39]报道，在体内实验中发现，使用腺病毒为载体携带靶向MMP2基因的特异siRNA干扰基因表达，可较高效地提升NSCLC放疗后的治疗效果；利用慢病毒携带靶向多聚ADP核糖聚合酶基因（PARP1）的siRNA序列对H1299细胞中该基因进行敲低后，可以显著降低NSCLC细胞转移前的上皮向间充质转变的过程发生[40]。但是它们也存在风险，限制了其在临床上的使用，例如慢病毒只能整合至分裂相的细胞；病毒载体会诱导靶向载体或转基因抗原的固有免疫应答和适应性免疫应答，从而限制体内慢病毒载体基因治疗的有效性和安全性[41]。
2 聚合物纳米载体
目前，各种阳离子聚合物都已成功开发为siRNA的递送载体，它们通常具有高分子量和高电荷密度，可以满足siRNA的有效融合，但核酸的递送率却较低，限制了这些非病毒载体的使用[42]。目前有部分新型聚合物载体获得了较好的效果。如利用二甲双胍合成的一种阳离子聚合物载体作用于mTOR靶点的效果较好[43]。ZHAO等[44]通过线性聚乙烯亚胺（PEI）与双氰胺的共轭成功合成了二甲双胍的聚合物结构PolyMetformin（PolyMet）。该载体保留了二甲双胍激活AMPK、抑制mTOR通路诱导肺部肿瘤的自噬和凋亡的能力。同时，它还可以包裹siRNA药物作用于相应靶点发挥作用，ZHAO等[44]利用该载体包裹VEGF-siRNA来考察其性能，基因沉默效率高达95%，对NSCLC细胞H460的生长抑制高达80%。同时，PolyMet的双胍基团降低了PEI的毒性，其阳离子聚合物特性将siRNA药物包裹到纳米颗粒中，这都充分证明该聚合物载体的优越性，也充分证明了该类载体用于递送siRNA药物的潜力。
3 脂质纳米载体
目前肺癌相关的siRNA药物的递送策略中，常用的递送系统是LNP。这些LNP可通过改变大小、形状和电荷等物理化学性质来增强作用、肿瘤靶向和延长血液循环时间[45]。LNP具有高负载能力，还可以通过与肿瘤细胞膜的吸附相互作用显著增强细胞内化。
LI等[46]开发了一种可以有效共递送VEGF siRNA和依托泊苷（ETO）的LNP纳米载体，其中的纳米粒子由负载VEGF siRNA和ETO的阳离子脂质体组成，该LNP是通过静电吸附和疏水相互作用，将聚乙二醇化的多用途聚组氨酸接枝壳聚糖硫酸（HCL）修饰成阳离子型Lip，并构建了多功能共传递囊泡PHCL-Lip。其中囊泡屏蔽Lip的正电荷提高血液循环的稳定性，LNP载体则将siRNA高效递送到肿瘤部位有效实现了肿瘤转移抑制，该载体基因沉默效率高达74%，有效沉默了肿瘤细胞中的靶基因，较之对照组细胞杀伤活性高出2.26倍。且该载体使用PHCL修饰，有效提高了体内靶向性，靶向肿瘤的能力增加了一倍以上，同时还减弱了载体的体内毒性。显示出用于递送siRNA药物的优越潜力。
结语
肺癌在晚期的治疗选择可能仅限于化疗，而传统的疗法存在副作用大、疗效不佳和易耐受等问题。在过去的几十年，小分子RNA靶向治疗取得长足的进步，其中siRNA疗法平台日益成熟且靶点效率更高，已有相关治疗方案进入了临床试验[47]，其在肺癌治疗中有着显著的优势。首先，随着高通量测序等精准医疗广泛普及，可以通过siRNA疗法精确针对个体设计个体化治疗方案，克服肺癌患者常具有的遗传异质性。同时，siRNA作为序列特异性基因沉默剂，可以显著扩大“可药用”靶标的特异性和范围。由于信号通路相互关联，可以对核心蛋白的上游基因干扰，通过多通路影响肿瘤的状态，多维度破除肿瘤生长优势。最后，siRNA疗法迈向临床转化的另一难点是载体构建，如今研究人员极大改善了载体的生物相容性、基因沉默效率、载体靶向能力和细胞摄取等能力。总体而言，对以siRNA为基础的新型疗法的研究前所未有地点燃了人们对于肿瘤个体化治疗的信心与兴趣。
参考文献
排版：凡默谷公众号
E.N.D
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