【诺奖深度解读】噬菌体展示技术为啥获得了化学奖？

From Zique 科学大院 2019-04-03

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10月3日，瑞典皇家科学院决定将2018年诺贝尔化学奖的一半授予弗朗西斯·阿诺德（Frances H. Arnold），另一半同时授予乔治·史密斯（George P. Smith）和格雷格·温特（Gregory P. Winter）爵士，以奖励他们在各自领域所作出的杰出贡献。

获诺贝尔化学奖的三位科学家图片来源：诺贝尔官网

其中，弗朗西斯·阿诺德获奖的理由是她首次进行了酶的定向进化。这些通过催化化学反应方式定向进化产生的蛋白质有着广泛的应用领域，包括生物燃料、药品等等。另一位获奖者乔治·史密斯发明了一种被称为“噬菌体展示”（phage display）的技术：这让能感染细菌的病毒可以用来进化新的蛋白质。而格雷戈里·温特爵士则利用噬菌体展示技术生产了新的药物。如今，噬菌体技术可产生抗体，用以中和毒素，对抗自身免疫性疾病以及治疗转移性癌症。

接下来，就让我们来看看这三位诺贝尔化学奖得主是如何成功地利用基因变化和自然选择，研究出可以解决人类化学领域问题的蛋白质的。

酶的定向进化

弗朗西斯·阿诺德是诺贝尔化学奖史上第5位获奖的女性。从20世纪70年代开始，她就尝试重建酶结构，以赋予其全新的性质。

酶（enzyme）是由活细胞产生的且对底物具有高度选择性和高度催化效能的蛋白质或RNA。在酶的作用下，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效地进行。酶可以由数千种氨基酸组成，它们以长链连接在一起，长链折叠构成特殊的三维结构，结构内部产生催化反应所需的合适环境。随着研究的逐渐进行，阿诺德意识到，即使运用现代计算能力也难以彻底获悉酶的特性，但她在自然界找到了新的灵感——进化。

她的团队从一种存在于自然界的枯草杆菌蛋白酶开始研究，对其基因进行了分析；然后他们使用不同的技术令基因变异，并将新的变异片段重新插入细菌中。这种细菌会产生数千种不同的枯草杆菌蛋白变体，研究人员根据需要对其进行筛选，比如快速发挥作用或是在高温以及存在某些特定化学物质的条件下才发挥作用。阿诺德在第三代枯草杆菌蛋白酶中，发现一种变体溶解在DMF（有机溶剂二甲基甲酰胺）时的催化效果比原始酶高出256倍。

利用这种方法，研究人员产生了能够催化原本自然界中并不存在的反应的新型酶。定向进化是实验最重要的一环，如今阿诺德定制的酶已在药品制造、可再生能源、环保行业大展身手，给创造一个绿色世界的人类梦想增添了强劲的活力。

作用于硅片上的酶，图片来源：PNNL on Visual Hunt

噬菌体展示技术让蛋白质定向进化

噬菌体本质上很简单，它主要由蛋白质和核酸（DNA和RNA）组成，是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称。噬菌体繁殖时，它们将遗传物质注入宿主菌并劫持宿主的细胞器，然后宿主菌产生了噬菌体的遗传物质和胶囊蛋白，新的噬菌体便得以形成，即完成了噬菌体的繁衍。

噬菌体结构示意，图片来源：Adenosine@维基百科

乔治·史密斯的“噬菌体展示”技术的基本原理就是将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面。被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性并暴露于噬菌体表面。导入各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成了一个呈现各种各样外源肽的展示库。当用一个蛋白质去筛查一个噬菌体展示库时，具体的操作过程其实是用这个蛋白质与该库中的全部噬菌体同时进行反应，以测试蛋白质与噬菌体的结合能力。所用的蛋白质会选择性地同（暴露于特定噬菌体表面的）某个外源肽相结合，从而分离出展示库里的某个特定的噬菌体。

乔治·史密斯奠定了噬菌体展示技术基础。该方法简单明了，它的优势在于能在蛋白质与其遗传信息之间提供直接的物理联系，人们可以有效的对所需功能的克隆进行反复筛选，并随之对其进行扩增，最终实现蛋白质的定向进化。

噬菌体展示技术让抗体定向进化

研究人员一直希望研究出能够阻断体内各种疾病过程并起到药物作用的抗体，抗体药物的发展也历经了多次进化：从最初的鼠源抗体，二代人鼠嵌合抗体；三代人源化抗体，再到四代的全人源抗体。人源抗体是基于噬菌体抗体库的技术手段而得到的抗体。

噬菌体抗体库技术主要方法是将B淋巴细胞轻链和重链基因库扩增，再融合到噬菌体衣壳蛋白中，经噬菌体表面展示系统表达后形成的噬菌体抗体库。这类抗体库含有丰度较高的抗原特异性抗体，能够产生更多更好的抗体，而且这些抗体经过了免疫系统的亲和力成熟过程，因此可从这种免疫抗体库中筛选出对靶标亲和性高的抗体。

噬菌体抗体库的优点是直接将蛋白质与其基因联系在一起，再利用配体的特异性亲和力，最终将不同的蛋白或多肽挑选出来。这相对于传统的筛选技术，在时间周期、抗体类型、筛选范围、经济成本等方面有着突出的优势。通过噬菌体展示技术获得的抗体，不仅去除了鼠源抗体的免疫源性，而且免去了人源化操作，其筛选过程简单、高效，能在较短时间内获取亲和力较强的全人源抗体。

格雷格·温特建立了一个噬菌体库，其表面上有数十亿种抗体。从这个库中，他找到了附着在不同靶蛋白上的抗体。然后，他在定向进化抗体的帮助下升级了新的库，在这个库中的抗体与靶标的附着力更强。

格雷格·温特和同事们还成立了一家基于抗体噬菌体展示技术的公司。在20世纪90年代，公司开发出了一种完全基于人体抗体的药物：阿达木单抗。这是第一个从噬菌体展示技术得到的全人体单克隆抗体，它能针对性地结合人肿瘤坏死因子（TNF），并阻断TNF和受体的结合。2002年，该药物被批准用于治疗类风湿性关节炎，现在也用于治疗不同类型的牛皮癣和炎症性肠病。阿达木单抗的成功刺激了制药行业的发展。

噬菌体展示技术还可应用于癌抗体领域。癌抗体是来源于身体的杀伤性细胞，它们可以攻击肿瘤细胞，致使肿瘤生长减缓，在某些情况下，即使患有转移性癌症的患者也能治愈，这是癌症治疗的历史性突破。已经批准的另一种抗体药物可以中和炭疽细菌毒素，还一种则可以减缓狼疮症状。目前正在进行更多的抗体临床试验，例如抗击阿尔茨海默病的新药。

培养皿中的炭疽杆菌群落，注意箭头处的区域，此处因注入过噬菌体而令细菌无法生存

图片来源：CDC公共图书馆

化学新时代的到来

三位诺奖得主利用生物化学方法实现了自然生物分子的定向进化，他们研究的突破使得可用快于自然进化千倍的速度改良药物、燃料和其他产品成为可能。这是化学领域真正的定向进化，开启了一个全新的时代。

于变革中改变世界，图片来源：pixabay

参考文献:

（1）https://www.nobelprize.org

（2）Ward E S, Güssow D, Griffiths A D, et al. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli.[J]. Nature, 1989, 341(6242):544-546.

（3）https://baike.baidu.com/item/%E5%99%AC%E8%8F%8C%E4%BD%93%E5%B1%95%E7%A4%BA%E6%8A%80%E6%9C%AF/190351?fr=aladdin

（4）唐陶,陈冰冰,龙航宇,等.噬菌体对细菌感染的治疗作用及应用研究[J].中国兽医杂志,2018(3).

（5）蒋红欣.噬菌体抗体库技术在抗体研发中的运用[J].科学技术创新,2017(33):158-159.

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