用于低成本、快速疫苗生产的新兴技术
本文节选自《Emerging Technologies for Low-Cost, Rapid Vaccine Manufacutrue》，更多详细内容，请参考原文。
开发一种疫苗，从概念到上市，成本约为2-5亿美元，需要5-18年。此外，建造、装配和启用一个疫苗生产工厂约需要花费5000万-7亿美元，平均需要7年时间，而疫苗生产的前置时间在0.5-3年之间。
为更好地了解这种成本高昂且耗时的开发时间，文章回顾了现有的疫苗生产工艺。最早的病毒疫苗大量生产技术之一于1940年代开发，其平行使用鸡胚作为生产流感疫苗的“迷你工厂”。操作时，受精的鸡蛋接种病毒，然后孵育，以使病毒增殖。之后，将鸡蛋内容物汇合，病毒分离、纯化、在某些情况下灭活、制剂、灌装并包装。平均产量约为1-2个鸡蛋1剂疫苗。该生产技术已良好建立并被广泛使用。但是，其有以下缺点：1）由于鸡蛋供应有限，所以产能会受到较大的限制，特别是其对潜在的流行性流感病毒株敏感；2）鸡蛋中增殖的病毒与野生型病毒可能存在抗原性差异，所以不能诱导所需的免疫反应；3）可能导致某些患者出现鸡蛋相关的过敏。
为解决这些缺点，开发了基于动物细胞培养的病毒疫苗生产技术。为此，动物细胞体外培养，感染病毒。病毒在细胞内复制，同时也可裂解细胞。之后，裂解剩余的细胞，病毒使用微滤或碟片式离心机分离，使用热或化学试剂（如甲醛、β-多聚丙内酯或氮杂环丙烷）进行病毒灭活。随后，使用核酸酶降解遗传物质，结合使用超滤和层析技术纯化抗原。纯化的抗原制剂成疫苗，灌装并包装。基于动物细胞的疫苗生产技术具有以下特点：1）高生产成本；2）低生长率；3）高污染风险，需要高水平的无菌性；以及4）通过细胞基因工程以提高产量较为困难。
鸡胚和动物细胞培养生长的病毒在某些情况下会分解形成具有抗原特性的亚单位，致使其复制缺陷，进一步降低病毒引起疾病的可能性。除了灭活和亚单位抗原，通过在外源宿主中传代而衰减的完整活病毒也可制剂形成疫苗。活性衰减的病毒疫苗通常可诱导更强、持续时间更长的免疫效应，但导致疾病的可能性也更高。
全细菌疫苗生产时在合适的培养基中生长病原性细菌，然后通过过滤和/或离心，从培养基中分离细菌，且制剂通常伴随着冻干处理。全细菌疫苗可由活性衰减或灭活的细菌细胞组成，前者更为常见，因其可提供更高效价的免疫作用。细菌亚单位疫苗也已经开发出来，其可分为两个大类：毒素（解毒毒素）疫苗和荚膜多糖疫苗。这些疫苗的一个变种是偶联或糖偶联疫苗，其由抗原（通常为细菌多糖）共价连接至载体蛋白（如破伤风类毒素或CRM197）组成，可形成更加高效的疫苗。与减毒活疫苗相比，亚单位疫苗的免疫原性和接种效果往往较低。
病毒和细菌的蛋白质抗原可在宿主有机体内重组生产，如：1）E.Coli；2）酵母；3）昆虫细胞；4）动物细胞，其复杂性和成本依次增加。所有提到的疫苗生产技术都已经开发并应用于生产一种特定的疫苗或一类范围较窄的疫苗。但没有一种技术可以在少于2个月的货期内，以约1美元/剂的成本，生产范围较宽的抗原。这对于在低收入国家为婴幼儿疫苗接种提供低成本的疫苗以及迅速应对区域性疫情中的新威胁来说，非常重要，如2014年西非的埃博拉疫情以及2015-2016年的寨卡疫情。为满足这些迫切的需求，新的疫苗平台技术正在开发当中，以实现快速且低成本的工艺开发和规模放大，例如1）用于重组蛋白疫苗生产的人源化、高产量酵母平台；2）用于基于ADDomer和VLP疫苗生产的昆虫细胞-杆状病毒平台；3）外膜囊泡（OMV）和GMMA疫苗生产；4）RNA疫苗。这四种平台技术被选择，在于其较低的技术复杂性、可放大性、用于生产不同疫苗时的灵活性以及制剂产物的潜在热稳定性。相比其它疫苗平台和表达技术，如多肽疫苗、哺乳动物中的重组蛋白表达、E.Coli中的重组蛋白表达、出芽的病毒样颗粒、禽胚和相关细胞系中的重组蛋白表达、基于外泌体的疫苗，这四种平台技术可在更高的程度上满足上述需求。此外，这四种平台可呈现自我佐剂效应：Addomer和GMMA可通过编辑而在其表面展示佐剂样实体；人源化、高产量酵母可生产具有佐剂功能的蛋白质，而RNA分子可具有自我佐剂特性。这里，针对快速、低成本地生产较宽范围的疫苗种类，文章对这四种新兴的疫苗平台技术进行比较性评估。
四种疫苗平台技术的概述
表1所示为在传统酵母和昆虫细胞中表达的重组疫苗以及OMV和核酸疫苗的典型例子。这些现有的表达系统和疫苗技术与四种新兴的平台技术是相关的，可以认为是替代路线。这种替代性显示了使用分析的新兴平台技术进行疫苗生产的可行性。
表1. 使用新型疫苗技术：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、产OMV细菌和DNA疫苗生产的疫苗案例。
图1所示为疫苗生产过程的一般概况，以下是对制剂、质量控制、灌装、封盖和密封、标签和包装操作的一般概述。
图1. 疫苗生产过程的一般流程。
制剂工艺的目的是：i）维持活性成分的结构和稳定性，并以此维持疫苗的效力；ii）延长疫苗产品的保质期；iii）通过添加可刺激免疫反应的佐剂，来增强疫苗的效力；iv）尽量减少潜在的不良副作用；v）对于RNA疫苗，加强RNA被抗体生产细胞的摄取。
制剂时，抗原可吸附至铝化合物（如氢氧化铝）。新的佐剂，如toll样受体激动剂（如单磷酸脂A和免疫刺激CpG-模体寡核苷酸），显示能够更快地实现保护和提高效力。防腐剂（如含汞硫柳汞）也曾被添加到疫苗中，但是，这些防腐剂在大多数现代制剂中不再使用，因为生产技术无菌性的提高，不再需要防腐剂。疫苗可以是单价疫苗（含单一抗原的单一株）、多价疫苗（含同一抗原的两种或两种以上株或血清型）或组合疫苗（针对一种以上疾病或一种传染源的多种株的单价和/或多价疫苗的混合）。疫苗通常在液体相中配制的，然而，疫苗也要冻干以延长其保质期。通过制剂，以下参数被保持在可控的最佳范围内：溶液pH、离子强度、氧化还原电位、浓度和温度。
对于质量控制，使用氨基酸测序、Western blotting、凝胶电泳、HPLC等方法对疫苗活性成分进行结构表征（如氨基酸组成、部分氨基酸测序、肽图谱、脂质和碳水化合物结构、浮力密度、表位表征等）。此外，在制剂前也要例行检查抗原性和无菌性。对于制剂的疫苗，检测蛋白质和铝含量、热原和体内效力（以ED50确定）。此外，对于质量控制，在整个生产过程中需检测以下参数，并将其维持在最佳范围内：温度、压力、pH值、电导率、各成分浓度、均匀性、化学以及生物污染物的存在等。
制剂后的产品需通过质量控制，然后装入无菌玻璃小瓶、塑料小瓶、塑料注射器、玻璃瓶或塑料瓶中。然后，盖上盖子，密封，贴好标签，包装，以便分发。
原文：Z.Kis, R.Shattock, N.Shah, et al., Emerging Technologies for Low-Cost, Rapid Vaccine Manufacture. Biotechnology Journal, 2019, DOI: 10.1002/biot.201800376.
更多阅读