寨卡病毒样颗粒疫苗生产平台：稳定细胞系和连续灌流培养
来自巴西里约热内卢联邦大学等的研究人员在2019年的1期《Vaccine》杂志上发表了题为“Zika virus-like particles (VLPs): Stable cell lines and continuous perfusion processes as a new potential vaccine manufacturing platform”的文章。文中，研究人员指出，病毒样颗粒（VLP）是一种非常有前途的疫苗开发平台，因为这种模仿病毒的三维颗粒可以生产并以重复的方式递呈抗原，诱导强烈的免疫反应，而不含病毒基因组。实验获得了可组成性表达Zika VLP的稳定转染HEK293细胞。使用以FACS富集的稳定细胞系进行的小规模摇瓶研究显示，相比批次培养，每日培养基置换（间歇性灌流）可显著增强活细胞密度和VLP生产（~4倍），而在连接ATF-2细胞截留设备的受控生物反应器内进行的连续灌流实验可获得与小规模间歇性灌流相似的结果。所以，总结认为，使用组成性表达Zika VLP的细胞系，以搅拌式灌流生物反应器培养，是生产基于VLP的Zika疫苗候选物的非常有潜力的系统。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
寨卡病毒属于黄病毒科黄病毒属，其最早从非洲乌干达的恒河猴中分离出来，在2007年，第一次报导了其在密克罗尼西亚雅浦岛人群中爆发。2013年，法属波利尼西亚爆发了一次更大的疫情，根据收集的信息显示，ZIKV可导致成年感染者出现格林-巴利综合征。2015年，巴西也爆发了疫情，经证实，Zika病毒可感染孕妇，并导致严重的新生儿先天性畸形。所以，鉴于ZIKV感染的严重影响，世界卫生组织于2016年2月将其列为需国际关注的突发公共卫生事件。有数据表明，在全球48个国家和地区存在虫媒传播ZIKV的情况。目前有50多种ZIKV疫苗候选物正在研究当中。
病毒样颗粒是由重组的病毒结构蛋白组成的三维结构，其缺乏病毒基因组，并以重复模式展示可触发免疫源性的抗原。研究表明，以不同的Zika VLP结构免疫小鼠，可有效诱导小鼠体内中和抗体的形成，说明Zika VLP可作为疫苗候选物。在本实验中，使用结构蛋白的不同集合构建VLP结构（含或不含衣壳蛋白），颗粒以HEK293细胞表达生产。研究选择结构蛋白prM（前膜）和E（囊膜）构建Zika VLP，不含衣壳，因为此前有报导显示，对于黄病毒，这些蛋白足以体外自我组装形成VLP，且保护性中和抗体识别的表位主要在黄病毒的E蛋白中。
生产VLP的稳定细胞系的开发有助于构建经济的生产平台，以获得“可负担”的疫苗，克服大规模瞬时转染中，昂贵的DNA和转染试剂带来的挑战。此外，稳定的表达可允许使用连续灌流工艺，后者可在高细胞密度和稳态条件下操作，为细胞提供稳定且最优化的环境，提高工艺产量、降低成本并确保高产物质量。
材料和方法
细胞系开发和培养条件、VLP生产的分析、表达Zika VLP稳定细胞池的富集等操作，请参考原文。
在摇瓶中进行的动力学研究
实验使用经构建、可稳定表达Zika VLP的悬浮驯化HEK293SF-3F6细胞系，在摇管中进行批次和假灌流（PP）研究，以评估细胞行为，起始工作体积15mL。细胞以0.5x10^6 cells/mL接种，使用HEK TF培养基，每日取样评估细胞生长、活性、葡萄糖消耗、乳酸浓度以及VLP生产。在假灌流中，使用两种补液策略，均在第4天开始，摇管体积调节为10mL。从第4天开始，细胞悬液每天离心，使细胞截留，然后置换培养基。在第一种假灌流策略中，根据细胞对葡萄糖的需求，步进式补液：葡糖糖浓度高于2g/L时，0.5vvd；1-2g/L时，0.75vvd；低于1g/L时，1vvd。第二种策略基于恒定的1vvd培养置换率。
在搅拌罐生物反应器内进行的灌流培养
灌流培养在搅拌罐生物反应器内进行（Applikon），反应器配置作为细胞截留设备的交替式切向流过滤系统（XCell™ ATF-2），ATF使用孔径0.2μm、内径1.0mm、表面积0.13m2的微滤聚醚砜中空纤维组件。实验室规模生物反应器以0.5 x 10^6 cells/mL接种，培养条件为37℃、pH 7.1、DO 40%、搅拌速度200-300rpm，工作体积0.9-1.1L。灌流在第3天开始，最高置换速率0.35vvd，然后逐步增加至1.5vvd，以保持稳态下葡萄糖浓度约为1g/L。从第7天开始，控制细胞去除（cell bleeding），以使细胞浓度维持为25-30 x 10^6 cells/mL。
结果
ATF系统在第2天启动，比真正开始灌流提前一天，这样操作没有观察到对细胞行为的负面影响，说明ATF系统内的剪切应激对细胞无害，且有可能可帮助降低HEK293细胞的聚集。从细胞生长考虑，由于HEK293细胞的高氧需求，为避免氧限制，在第7天开始细胞废弃，此时活细胞浓度到达约25 x 10^6 cells/mL。从此时起，维持25-30x10^6 cells/mL的稳态，根据细胞需求，每日计算灌流速率，以维持葡萄糖浓度为1g/L。步进式补液策略成功执行，与1vvd的恒定补液相比，其可降低灌流开始时的培养基使用，与小规模假灌流实验结果一致。
以灌流模式进行的VLP生产。（A）细胞培养过程中的活细胞密度和活性。（B）灌流过程中的葡萄糖和乳酸浓度以及培养基置换灌流速率，以vvd为单位。（C）生物反应器及收获液中的VLP浓度，使用Zika VLP的E蛋白作为检测标准（R.G.F.Alvim, et al., 2019）。
在本研究中，应用1.5vvd的灌流速率，为确保生物反应器内合理的葡萄糖浓度，并保证生物反应器可稳健地连续操作1个月。与此灌流速率相应的细胞特异性灌流速率（CSPR）为50-60pL/cell/day，这比此前确定的最佳CSPR高3倍。后续试验将研究补液策略以及灌流培养基成分的优化，以降低培养基的使用，节省成本。但尽管需要进一步的优化，研究认为目前的“概念验证”工艺相比基于完整病毒批次生产的传统方法具有更好的经济效益，特别是考虑到VLP可在低生物安全水平的工厂进行生产，而灌流系统可提供更高的单位体积产量，且所需生物反应器尺寸更小，厂房占地更低，资金投入也更低。
总结
VLP由于其安全性和重复的抗原递呈，是用于黄病毒疫苗生产的非常有潜力的疫苗平台。此外，VLP代表了通过整合突变、以纳入定制化分子特性的可能性，这对于降低交叉反应性以及感染的抗体依赖性增强来说非常有意思。
此处的结果确认了使用可组成性表达Zika VLP的稳定转染细胞的灌流技术作为疫苗生产平台的潜力，其有助于ZIKV疫苗生产的大规模、经济型技术的开发，此策略也可用于其它整合了定制化分子特性的Zika VLP结构的生产或者其它病毒VLP的生产。
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：R.G.F.Alvim, I.Itabaina Jr., L.R.Castilho, Zika virus-like particles (VLPs): Stable cell lines and continuous perfusion processes as a new potential vaccine manufacturing platform. Vaccine, 2019, https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.05.064.
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