病毒载体疫苗：生产挑战和纯化策略
相比数十年前，今天的疫苗显然更安全、有效，也更容易获得，生物工艺的创新、稳定的资金来源以及厂商和公共卫生机构之间的合作，都将确保该领域的继续发展。但是，新型复杂病原体的出现，如人免疫缺陷病毒（HIV）或者是埃博拉、寨卡病毒以及近期的冠状病毒，已经暴露出了传统疫苗生产策略的局限性。长期以来，疫苗依赖于诱导患者抗体介导的、对减毒或灭活病原体的应答，这种方法对抗原变异率降低的病原体非常有效，因为这些病原体很容易通过基本的体液免疫反应加以控制，如白喉、乙肝、麻疹、腮腺炎、脊髓灰质炎和破伤风等。然而，典型的减毒/灭活策略在启动细胞介导的免疫反应方面不太成功，而这在对抗更为棘手的细胞内病原体方面至关重要。病毒载体为疫苗研究、开发和生产提供了一条非常有前景的路径。
基于病毒载体的疫苗可以解决多方面的挑战，这种新一代的疫苗策略结合了减毒活疫苗和DNA疫苗方法的最佳特性，利用无或低免疫源性病毒的感染性，将目标病原体的抗原编码基因递送至宿主细胞，模拟感染事件。由此获得的、携带特定抗原的转导细胞可刺激产生抗体以及CD4辅助T细胞、细胞毒性T淋巴细胞以及其它细胞保护。
相比传统疫苗设计，这种方式具有几个关键优势。首先，因为病毒载体疫苗是重组性产品，其可使用目标病原体DNA的“无害”片段来设计，而相比之前的方法，其携带的传染性颗粒也较少。所以，此类疫苗可规避重新激活病原体、将类毒素转化为产毒形式以及将共纯化污染物传递给疫苗接种者等问题。重组策略还可根据给定载体接受外源DNA的能力，实现多价和多病原体疫苗的生产。
载体疫苗是一种新型策略，其回报也将是巨大的，目前，全球已有数十个项目已经进入临床试验阶段，但是，在这方面仍有很大的未知性，如经济、高效的生产策略的建议以及用于病毒定量的分析技术。
用于疫苗开发的常见病毒载体及其应用、优/劣势（B. Gazaille, et al, 2019）。
重组病毒载体疫苗的优势
相比传统技术，重组疫苗可提供多方面的优势，最显著的优势包括：
由于利用已良好鉴定的抗原，所以可诱导更加“靶向”的免疫反应
提高工艺稳定性
更好的工艺安全性，即不需要高安全级别的实验室来生产具有高度细胞毒性的病毒）
由于现在已可进行广泛的分子工程处理，重组病毒载体疫苗从设计初衷上就更加安全，可敲除病毒复制所需的病毒性基因，使其仅作为“抗原载体”，而不能复制，也可以通过改变其天然趋向性以及通过使用组织特异性启动子，关闭在非靶细胞中的抗原表达，从而控制载体感染的特定细胞。通过增强所需病毒性病原体的表达以及消除可能干扰目的免疫反应的病毒性病原体，增强疫苗效力。
用于疫苗和基因治疗的病毒载体的主要区别
两者之间最关键的区别在于免疫反应。疫苗旨在形成免疫反应，而对于用于基因治疗的载体，则不希望发生免疫系统反应。所以，基因治疗一般使用低免疫源性的载体。由于免疫反应是免疫接种需要的结果，用于检测反应的分析工具可用于对疫苗进行表征。病毒载体的效力在于其转染目标细胞以及递送目的功能基因的能力，已有多种不同的方法可用于此目的。
但是，目前用于病毒载体生产的分析方法还不是非常稳定和精确。相比重组蛋白和mAb，病毒的复杂性使得分析检测具有不小的挑战性。另外，由于上市时间也是重要的考量因素，所以，开发高通量的分析方法也是病毒载体疫苗生产的重要要求。
病毒载体常用分析方法（M. Redfern, 2019)。
病毒载体的下游纯化挑战
尽管在一定程度上，病毒载体和重组蛋白生产有一定程度的相似性，两者之间的绝大部分区别在于与病毒特性相关的技术问题，此外，目前病毒载体通常在相对较小的规模下生产，且更多使用贴壁细胞，所以用于病毒载体生产的设备与重组蛋白或单抗的大规模操作会有不同。
总体来看，开发用于生产重组蛋白和mAb的先进分子、细胞生物学技术已经成功用于病毒载体的上游生产。在过去十年间，上游工艺可获得病毒滴度已经提高了~10倍，虽然达到最佳的生产，可能还需要再提高~10倍，但发展方向是正确的。
但在下游，即使使用最先进的技术，也很难保证病毒载体的高产量。很多情况下，病毒载体工艺的总体下游收率仅为30-40%，甚至更低，而mAb一般可达到80%。所以，纯化技术并不能直接从mAb嫁接到载体上。
AAV不同生产系统产生的、需在下游工艺中去除的杂质（M. Hebben，2018）。
而且，使用不同的载体平台，可能会产生不同的问题，而大部分问题源于上游工艺，相比分泌型重组蛋白，进入下游工艺的病毒颗粒纯度通常相对较低，所以，病毒载体下游工艺需要的纯化水平通常较高。此外，与使用稳定细胞系表达的重组蛋白不同，大多数病毒载体平台使用基于多个质粒的瞬时表达，这通常会导致较高异质性的病毒 -颗粒混合物，需要分离具有相似粒径和表面特性而功能不同的颗粒。另外一个问题是，相比重组蛋白，病毒，特别是囊膜病毒，对剪切应激的敏感性要高得多，更提高了对工艺控制的挑战。而且，除少数病毒载体外，如AAV，大多数病毒载体缺乏针对性的高选择性亲和填料，增加了达到所需终产物纯度要求的难度，且部分病毒由于粒径较大，无法进行最终的除菌过滤，所以需确保每个单元操作的无菌性。总体来说，在进行病毒载体工艺开发前，需充分了解所用病毒的特性以及需要的终产品属性，才能快速而稳定地构建适合的工艺流程。
B.Gazaille, Viral vectors for vaccine: a virtual conversation on prodction and analysis. BioProcess International, 2019, 17 (12).
M.Hebben, Downstream bioprocessing of AAV vectors:industrial challenges & regulatory requirements. Cell & Gene Therapy Insights, 2018, DOI: 10.18609/cgti.2018.016.
Z.Kis, R.Shattock, N.Shah, Emerging Technologies for Low-Cost, Rapid Vaccine Manufacture. Biotechnology Journal, 2019, DOI: 10.1002/biot.201800376.
Repligen产品在病毒载体疫苗生产流程中的应用
适用于病毒载体疫苗UFDF的KrosFlo KR2i TFF系统
工作原理
主要部件
ProConnex流路
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