用于mRNA疫苗的数字孪生，优化速度、规模、稳健性、灵活性以及实时放行检测
本文节选自《Digital Twinof mRNA-Based SARS-COVID-19 Vaccine Manufacturing towards Autonomous Operation for Improvements in Speed, Scale, Robustness, Flexibility and Real-Time Release Testing》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
摘要：大量供应SARS-COVID-19 疫苗，以满足全球需求，会在产能方面存在不小瓶颈。对现有的mRNA（信使核糖核酸）疫苗工艺进行评估表明，需要由过程分析技术方法支持的数字孪生，以改善生产能力倍增的工艺转移，减少不合格批次失败，合格人员培训，以加快验证和高效操作，优化利用稀缺的缓冲液和化学品，以及更快的产品放行。本研究提出了pDNA（质粒脱氧核糖核酸）到 mRNA 工艺的数字孪生。此外，展示了第一个多传感过程分析技术 (PAT)的可行性。得出作为结果的工艺性能特点，并评估生产技术瓶颈。这种数字孪生策略可以指出潜在的改进点，例如裂解中降低稀释，以及可能减少必要的层析步骤。1g pDNA 可能生产大约 30 g mRNA。这将瓶颈转移到了 mRNA 工艺步骤，其指出共转录加帽是减少纯化步骤数量的首选选项。纯度要求通过多模式和反相层析的组合来满足，相比沉淀和乙醇-氯仿萃取，其是在工业化水平上更良好建立的单元操作。作为最后一步，针对稳定性、储存和运输物流要求，选择了冻干。UF/DF（超滤/洗滤）等工艺单元的整合将允许在脂质纳米颗粒(LNP) 制剂之前，调整最终浓度和缓冲液组成。完整的数字孪生被提议用于进一步验证生产规模以及在工艺优化和生产操作中使用。在获得第一个PAT 结果之后，应对不同批次和工艺步骤进行详细调查，以实施该策略，实现过程控制和可靠、高效的操作。
人们从一开始就知道，在大流行危机中为全体人类提供疫苗是任何社会都将面临的主要科学、技术和组织挑战。本文将讨论关于技术挑战和潜在解决方法的争论。
很明显，上市的速度和足够的产能将可以挽救健康、生命和经济状况。然而，必须在不牺牲政治利益的情况下满足监管要求。通常情况下，决策必须由数据驱动，不能妥协。在任何民主国家，产生数据并做出任何得到社会广泛支持的决定都需要时间。然而，将疫苗开发与不同地区的上市途径进行比较可见，有些有组织的政府系统运行得很好，也有一些运行得不好。疫苗开发的历史表明，从第一个可用的产品到患者使用需要相当长的时间，即使加快速度，也可能需要几十年到至少10- 15年。本文将重点介绍最近在不到一年的时间内成功接种SARS-COVID19疫苗的情况，以及特别成功的多种新疫苗类型，如mRNA。
病毒类型和作用机制的阐明非常快，第一个疫苗产品的思路，包括初步临床试验，亦是如此。在世界范围内，科研、学术和工业界几乎完全开放的交流，以及临床试验候选产品的即时可用，都加快了这些步骤。这一速度也是基于在这一专业领域中具有多年专业经验的敬业的科学家。总的来说，一方面，杰出的个体表现，另一方面，国家或公司的创新体系允许长期的“小领域”基础科学研究；这看起来似乎与现代化管理与政治理论相矛盾。
然而，当需要世界级规模的生产时，这一非凡的成功故事似乎就结束了。全球所需的疫苗供应岌岌可危。在制药行业，管理生产技术被视为“家政服务”；工作的重点往往被更多地放在新产品开发、临床试验和监管批准上。生产被认为是随手可得的，没有预算或技术问题。而与此相反的是，由于管理的原因，平均每家制药公司每年都需要放弃1-2种药物，这是由于生产技术方面的挑战所导致的，这对患者和医疗保健系统以及公司预算来说都是相当遗憾的。
最后，快速的国家投资为中小企业和初创企业在药物研究方面提供了获得快速进展的机会，这些企业很多时候会在经历一些波折之后，得到融资，并得到“大制药公司”等“无私”投资者的长期资助和支持。这种政府财政的支持使得小公司能够与合同制造组织(CMO)公司建立快速合作，以加快提升生产能力。
实际的病毒疫苗生产技术的好处是规模非常小，因为所需的剂量很少，量级仅为μg级别。然而，稳定的制剂体系基于大分子在运输和储存过程中的生物有效性。特定冻干和脂质纳米颗粒技术对于稳健的操作来说仍是一个挑战。
一份生产技术分析调查报告显示，生物制品生产部门面对的问题与过去几年几乎相同，但去年在优先性上略有变化。生产已经上升到第二位，排在第一优先的针对质量、组织和文件的监管投诉之后。人员资格确认一直排在第三位，但设备缺陷至少已排在了第4位，而对计算机系统的抱怨则失去了关注。
在开发过程中根据模糊的假设订购生产设备的典型挑战在SARS-COVID19 疫苗策略中则没有问题，因为已知市场上的任何产品都会被出售。因此，根据定义排除了由于市场未知渗透导致的正常延迟，其导致不适当的规模、计划和尺寸以及随后的非最佳操作设备。然而，下一个优先性障碍，即由于可变性导致的任何不合格 (out of specification，OOS)问题仍然存在，尤其是对于 mRNA 疫苗类型和脂质纳米颗粒 (LNP) 制剂等新产品技术而言，这是一个主要挑战。
调查统计数据表明，在小规模工厂中，大约有10%的批次失败，污染率甚至更高，同时由于操作失误造成的损失高达5倍。
从任何生产操作的角度来看，这一趋势清楚地表明，需要建立基于数字孪生和过程分析技术的先进过程控制系统，以应对传感器漂移、工艺差异并允许实时放行检测，以减少工作量，并改善批次差异性。40-80%的生产工作都被用于质量保证QA。这使得对开始技术改进的需求变得很明显。如图1所示，通过关于瓶颈、挑战和威胁的SWOT (优势、劣势、机会和威胁)分析，总结了需要解决的主要挑战。
图1. 瓶颈、挑战 & 威胁的典型SWOT分析
目前有多种类型的疫苗，包括已获批准的和正在开发当中的，其可以区分为三种主要的亚型：已经含有诱导免疫反应的刺突蛋白的疫苗；病毒载体，主要是AAV，其将编号刺突蛋白的DNA序列递送到细胞中；本文将讨论的mRNA疫苗，以mRNA形式携带刺突蛋白的基因信息，在患者细胞中直接形成蛋白，其一般通过LNP递送。
图2. 候选疫苗、生产商、技术和试验阶段示例。可以区分为三种主要的类型：已经含有诱导免疫反应的刺突蛋白的疫苗；病毒载体，主要是AAV，其将编号刺突蛋白的DNA序列递送到细胞中；本文将讨论的mRNA疫苗，以mRNA形式携带刺突蛋白的基因信息，在患者细胞中直接形成蛋白，其一般通过LNP递送。
mRNA生产
作为起始点，mRNA的合成需要包含各自刺突蛋白遗传密码的模板DNA。虽然完全无细胞的DNA生产是可行的，而且有可能即将投入使用，例如狗骨（doggy-bone）技术（Touchlight Genetics），但目前最先进的技术仍然是通过大肠杆菌发酵，然后纯化和线性化生产质粒。在下一阶段，线性化的DNA作为模板在体外转录。传统上转录和加帽是单独的工艺步骤，而现代技术已使共转录加帽成为可能。
图3. mRNA疫苗生产的主要工艺阶段和中间产物。mRNA的合成需要作为起点的模板DNA，其包含各自的刺突蛋白遗传密码。目前的技术水平仍然是通过大肠杆菌发酵制造质粒，然后进行纯化和线性化。在下一阶段，线性化的DNA作为模板进行体外转录、加帽和制剂，包括LNP中mRNA的包封。
文献中报道的对所获得的mRNA进行纯化的工艺多采用平台技术。就像单克隆抗体平台技术一样，相同的工艺步骤可以用来制造不同的抗体衍生物，现有的mRNA工厂，或者至少相同的工艺步骤，可以用来制造不同的mRNA疫苗。但是，与抗体生产相比，在采用何种分离技术和执行顺序方面，纯化策略并没有标准化。
已经有文献介绍了各种不同的分离技术和整体纯化策略。虽然对于已知mRNA候选疫苗，转录、纯化和最终包封到脂质纳米颗粒的关键步骤基本相同，但中间的纯化步骤却不一样。
例如，CureVac将与拜耳合作生产即将获批的CVnCoV疫苗（译者注：原文发表于2021年4月，彼时，CureVac尚未公布III期数据），而此前该公司申请的一项专利公开了一项生产工艺，其关键纯化序列包括转录和加帽、LiCl沉淀、反相、层析、乙醇沉淀、冻干、无菌过滤。在这个工艺概念中，步骤5和步骤6之间的必要浓度调整是通过将冻干产品重悬到适当量的制剂溶液中来完成的。据我们所知，公司没有披露该工艺策略是否也将用于生产CVnCoV。不过，CureVac将与拜耳、Rentschler、Wacker以及Fareva等公司合作生产疫苗。
BIA Separations提出的一项工艺序列，旨在简化mRNA的纯化，无需沉淀步骤，简化规模放大过程，并提高产量，其包括转录、多模式层析、加帽和亲和层析。这一顺序可能至少需要增加一个UF/DF步骤，以调整浓度，以及必要的无菌过滤步骤。
Kis等人在RNA生产评估研究中作为框架的另一个工艺概念使用转录和加帽、切向流过滤、洗滤、多模式或离子交换层析、切向流过滤、洗滤和无菌过滤顺序。在这些步骤之后，Kis等人使用的概念工艺进入下一步的工艺阶段，包括LNP制剂和灌装。
在欧盟以Comirnaty为商品名被批准并上市的BNT162b2，其生产工艺大部分未披露。虽然针对所有市场的模板质粒DNA都是在美国Chesterfield生产的，但转录工艺的执行却是有市场针对性的。对于美国市场，转录主要在辉瑞位于Andover的工厂完成，而对于欧盟市场，转录则在位于德国Marburg的BioNTech生产基地完成，该基地于2020年9月从诺华收购，以扩大BioNTech的生产能力。LNP包封同样在不同的地点进行，即辉瑞在美国Kalamazoo和比利时Puurs的工厂，以及最近宣布的诺华位于瑞士Stein的工厂。
虽然有报道称，Moderna的疫苗在欧盟的生产是在龙沙位于瑞士Visp的生产基地进行的，但LNP的包封以及灌装由西班牙公司Rovi Pharma Industrial Services负责，但没有披露生产工艺的细节。
pDNA的生产已经发展成为一个平台工艺。大肠杆菌发酵后的碱裂解和澄清是行业标准方法，只是层析步骤的数量不同，其取决于所生产的pDNA的纯度要求和应用。因此，本文选择阴离子交换（AEX）整体柱作为针对后续mRNA处理的充分纯化步骤。工艺规模的选择基于文献报道数据，将在后文进行讨论。mRNA工艺基于行业标准的共转录加帽，因为它比转录后加帽方法少一个纯化步骤。因此，工艺速度更快。图4总结了文献中报告的工艺和本文中描述的工艺框架。对于pDNA到mRNA的过程，基于文献资料、已有的知识和实验经验以及已有的、基本经过验证的工艺模型，我们提出了一个数字孪生。
图4. 已发表的和新的mRNA生产工艺的总结。(RP:反相，MM:多模式，IEX:离子交换)。数字表示流程的顺序。总结了三个工艺(灰色箭头)，代表已发表的生产mRNA的工艺框架。绿色箭头代表本文中讨论的工艺序列。
原文：A.Schmidt, H.Helgers, F.L.Vetter, et al., Digital Twin of mRNA-Based SARS-COVID-19 Vaccine Manufacturing towards Autonomous Operation for Improvements in Speed, Scale, Robustness, Flexibility and Real-Time Release Testing. Processes, 2021, 9, 748.
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