描绘细胞培养和细胞系开发的未来
本文节选自《Mapping the Future of Cell Culture and Cell Line Development》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
如果基于细胞的现代生物工艺要提高其大量生产生物治疗药物的能力 - 不仅仅是经过验证的抗体，还包括双特异性和三特异性抗体，以及病毒抗原和其它新型疫苗 - 它将不得不解决某些上游生产方面的挑战。这些挑战的核心是 - 你猜对了 – 就是细胞。有时候，这些细胞只是需要更好的调节和一点“呵护”。在其它时候，如果稍加修改，或者进行大的修改，它们可能会表现得更好。
这些方案在8月16-17日举行的第17届细胞培养和细胞系优化年会上进行了讨论。GEN找到了本次活动的几位主持人，他们介绍了自己的最新工作，并分享了他们对行业的看法。
我们在这里介绍科学家的评论。从克隆筛选技术 (如组学、光流学和siRNA)到连续监测。一些评论甚至反映出了一种超越细胞的意愿，即考虑到了无细胞生产的潜力 - 鉴于mRNA疗法的兴起，这是一种越来越有吸引力的生产方式。
克服限速步骤
纽约州立大学理工学院纳米生物科学教授Susan Sharfstein博士说:“在将新药推向市场的生物工艺过程中，细胞系的开发仍然是限制速度的步骤之一。一些最大的挑战包括克隆的稳定性和自然从未想过的分子的生产，比如双特异性抗体。”
生物药制造商经常利用抗生素耐药性来选择新的克隆。另一种方法，名为PTSelect的基于RNA的纳米开关技术，正在纽约州立大学理工学院开发当中。通过转染PTSelect-siRNA调控的CD4/siRNA mRNA，并利用CD4在细胞表面的可变表达，可以将含有稳定整合目的基因(GOI)的细胞从无GOI的细胞中分离出来。
Sharfstein认为，这些挑战肯定与中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的开发有关。CHO细胞系建立于20世纪50年代，它们已成为主要的哺乳动物细胞系选择。事实上，70%的生物治疗药物都是由其生产的。它们提供了多种正确折叠、适当糖基化的蛋白质，并具有与人类兼容的翻译后修饰。他们还提供了高产量以及与大规模培养和化学限定培养基的适应性。
“CHO细胞存在固有的遗传不稳定性和可变性，”Sharfstein强调。“这对这个行业有很大的好处，但也有一些缺点。”
Berkeley Lights CLD产品管理主管Renee Tobias也提出了类似的观点。她说:“细胞系中生产的用于生物治疗或诊断目的的高度工程化蛋白质容易出现聚集等质量问题。这种趋势对药物的可制造性、保质期和患者安全都有影响。”
克隆筛选是生物药生产的首要步骤之一。为了选择合适的克隆来表达目标蛋白，制药行业仍然依赖于传统的技术 - 表达抗生素耐受性基因和使用抗生素，如新霉素或二氢叶酸还原酶(DHFR)。然而，得益于Sharfstein和她的合作伙伴Scott Tenenbaum博士的研究，这种技术的高效替代方案可能很快就会出现。Scott Tenenbaum博士是纽约州立大学理工学院纳米生物科学副教授，也是纽约州立大学奥尔巴尼分校纳米生物科学与工程学院纳米生物科学的负责人。(他同时也是sxRNA Technologies的CSO。)
这项研究已经使Sharfstein和Tenenbaum能够设计出一种新的克隆筛选方法。在这种方法中，表达载体允许目的基因与非编码RNA(如小干扰RNA，或siRNA) 共转录。然后，一种编码细胞表面标记物的mRNA- 例如，CD4，其基因序列在中间被与siRNA互补的3'非翻译区域中断 - 被瞬时转染到细胞中。
当siRNA转录时(与目的基因一起)，中断CD4 mRNA的3'非翻译区域与转录的siRNA匹配，随后降解，产生不间断的、可翻译的CD4 mRNA转录本。CD4一旦被翻译，就可以在细胞表面表达，然后可以使用这种标记物选择细胞。其优点包括CD4的瞬时表达，与传统方法相比，该方法的速度快，而且不需要抗生素。
Sharfstein断言:“与传统方法相比，我们也获得了更多的基因表达阳性克隆。”Tenenbaum补充说，代理基因的使用，比如抗生素耐药性基因，之所以持续存在，是因为制药行业一直在使用效果足以得到监管部门批准的方法 - 尽管这种方法现在“相当过时”。
应用组学和光流学
另一个有助于推动克隆筛选的、令人兴奋的发展是组学和生物信息分析的利用。Seagen生物工艺与分析科学家Sofie O'Brien博士说，她的团队的工作重点是生物信息学，以及如何将其用于CHO细胞系的开发，特别是克隆筛选，以更好地理解转录模式。该团队希望生物信息学方法可以使鉴别转基因整合的位置变得更容易。
Seagen正在开发一种技术，可以加速对新克隆进行稳定性研究。这样的研究需要大量的时间和资源，而且它们往往被证明是细胞系开发的限速步骤。
O'Brien评论说：“通过应用组学，我们在细胞系开发中使用了更全面的方法。这种方法让我们更全面地了解影响我们细胞系的因素，可能也可节省时间和资源。”
在Berkeley Lights，Tobias和她的团队专注于光流技术在克隆筛选方面的应用。通过将克隆选择的早期阶段作为目标，科学家们希望将后期失败的风险降到最低，并确保获得所需产品的正确数量和质量。
Tobias断言:“使用Beacon系统，数千个细胞可以在微量规模上并行克隆和分析，减少扩增时间和处理平板的步骤，所需人工是传统克隆筛选的1/30。因此，我们的技术对SARS-CoV-2疫苗和抗体的开发产生了重大影响。”
这包括与Trent Munro博士领导的研究团队的合作，他是昆士兰大学澳大利亚生物工程和纳米技术研究所的教授和高级小组负责人。Munro和他的同事能够加速整合细胞系开发以及生产重组蛋白疫苗的过程。科学家们证明，从开始细胞处理到给患者用药，这个通常需要数年时间的过程可以在78天内完成。
Tobias引用的另一个例子是范德比尔特大学医学中心的James E. Crowe, Jr. 医学博士领导的实验室。当该实验室将Berkeley Lights的Opto™ PlasmaB Discovery工作流应用于其Beacon光流控系统时，能够更快地找到针对SARS-CoV-2的抗体。可生产抗体所需的开发时间从24个月减少到了25天。这一结果是在为阿斯利康目前的三期临床试验提供抗体的项目中获得的，它表明了专注于尽早获得正确克隆的优势。（原文发表时间为2021年8月。）
连续监测的角色
一旦正确的克隆被选择和扩增，确保大规模培养是健康和可行的，对于获得一致的蛋白质表达来说至关重要。常用的检测细胞健康的方法，包括传统的台盼蓝染色，可提供快速的信息，但并不总是完全准确的。
爱尔兰国家生物工艺研究和培训研究所 (NIBRT) 细胞技术组的首席研究员Michael Butler博士说：“台盼蓝已经被用于检测细胞活性一个多世纪了，而实际上它是检测细胞膜完整性的缺失。挑战在于让行业相信，这可能不是衡量细胞活性的最佳方法。”
JM Canty International和位于都柏林的国家生物工艺研究与培训研究所(NIBRT)最近进行了合作，应用Canty的Pharmaflow细胞成像系统。使用Pharmaflow，用户可以实时监测细胞活性，其具有高分辨率，且不需要细胞染色。为了监测细胞代谢和相关活动的变化，用户可以利用该系统的光学和介电能力，这允许实现灵敏且准确的重组蛋白生产评估。
他的团队一直在研究使用光学和电介质来监测哺乳动物细胞，并针对生物工艺开发一个自动连续监测系统。Butler强调了这种方法提供的微妙之处。
“重要的是要记住，早期细胞死亡事件不会影响细胞膜的完整性，”他解释道。“因此，它可以保持完整，这是台盼蓝检测不到的。”
“对重组蛋白生产应用更灵敏、连续的监测将允许更大程度地监测细胞代谢变化，并允许选择在早期阶段终止培养，在失去膜完整性之前 - 潜在地减少所需重组蛋白被宿主细胞蛋白污染的情况。”
无细胞mRNA生产
正如抗体和其它蛋白质已经成为治疗模式一样，它们的价值可能会更高 - 如果它们能更有效地生产的话。正是这种可能性推动了本文所描述的技术的发展。
在德国Marburg BioNTech工厂的一个50升生物反应器中，使用体外转录生产mRNA。在上图中，一名生产操作员在生物反应器中进行过程中质量控制检测。每批大约可以生产800万剂疫苗，具体取决于疫苗的种类。
尽管这些技术有望改善细胞培养和细胞系开发，从而简化抗体和其它蛋白质的生产，但它们可能并不理想地适合于其它生物制品的生产，包括在整个COVID-19大流行期间受到国际关注的那种生物制品。
在大众的想象中，这些生物制品的例子就是辉瑞-BioNTech和Moderna对抗SARS-CoV-2的疫苗。当然，这些生物制品都是基于mRNA的产物。它们的上游生产不需要细胞培养。相反，它们可以通过无细胞生产来实现，避免了基于细胞的治疗药物所面临的多种挑战。
辉瑞-BioNTech基于mRNA的COVID-19疫苗是在欧洲的数家BioNTech工厂生产的，包括位于德国Marburg的一家工厂。上图中，Marburg工厂的生产操作员正在操作一个将mRNA包裹在脂质中的系统。由于该系统使用的是纯、加压乙醇 - 一种爆炸性溶剂 - 技术人员必须穿防静电靴。无细胞生产周期相对较短。事实上，整个过程大约仅需要两个星期。
BioNTech RNA生物化学和生产高级副总裁Andreas Kuhn博士说:“原则上看，mRNA不是一项新技术，尽管在大流行期间，世界已经意识到它的许多优势。” 根据Kuhn的说法，这些优势包括更大的生产灵活性，以及比基于细胞的平台更容易放大。
“mRNA的生产工艺是一个高度可放大且稳健的工艺，”他继续说。“它可以标准化，不需要针对每种新疫苗进行调整。同样的工艺也可以用来生产个性化的候选肿瘤疫苗。
“另一个优势是生产周期相对较短。整个生产过程在技术上只需要大约两周，可以灵活地适应新的mRNA序列。例如，可以更快地针对病毒变异株做出反应，这使得mRNA成为应对新出现的大流行威胁的理想方式。”
mRNA的生产依赖于基于酶反应的无细胞过程，在这个过程中，DNA作为模板与RNA聚合酶结合。当然，这一过程所需的酶是由培养产生的，尽管一般是微生物培养。
Kuhn评论称：“与需要哺乳动物细胞培养的生物治疗药物相比，我们的微生物来源起始物料的细胞培养占地更小。就工艺、时间和成本而言，后者的生产本质上比微生物源性酶的生产更复杂、更费力。”
Kuhn解释说，因为mRNA的无细胞生产仍然是一种新技术，具有合适质量的起始和原材料仍然需要很高的价格。然而，他预计，随着mRNA生产产量的增长，以供应未来几个月将需要的数以亿计的mRNA疫苗剂量，价格将会下降。
鉴于无细胞生物工艺比哺乳动物细胞生物工艺具有如此大的优势，生物治疗和疫苗的未来是否会主要基于mRNA？Kuhn说:“我们还有很多需要学习的地方，国际上正在研究这种技术的许多不同应用，以及与基于mRNA的疫苗和/或生物治疗存储相关的挑战。最终，我认为基于mRNA的疗法和疫苗很可能会在相比基于细胞的疗法中占有一席之地，例如抗体和细胞疗法以及病毒载体，一些模式比其它模式更适合某些应用和/或疾病领域。例如，在BioNTech，我们正在研究四种药物类别，mRNA只是其中之一。其它模式包括T细胞疗法、抗体和小分子免疫调节剂。”
专家们一致认为生物治疗药物的生产将继续依赖于哺乳动物细胞培养和细胞系的开发。专家们还表示，只要这些生产模式能够高效生产高质量的生物治疗药物，使患者受益并满足临床需求，就将激发创新和技术进步。
原文：P.Kalla, Mapping the Future of Cell Culture and Cell Line Development. Genetic Engineering & Biotechnology, 2021.
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