如何获得最佳的AAV载体下游生物工艺
本文节选自对IVERIC bio基因治疗下游工艺开发和生产副主任Eric Gershenow的专访。详细内容，请参考原文。
您现在在做什么?
EG：IVERIC bio拥有处于临床前开发阶段的、多样化的候选基因治疗产品管线，重点是孤儿遗传性视网膜疾病。目前，我在支持两种基于腺相关病毒载体(AAV)的候选疗法的GMP生产，以支持于2021年开始的人体临床试验计划。
IVERIC bio基因治疗平台和针对眼科疾病的治疗方法的不同之处是什么?
EG：IVERIC专注于利用新的基因治疗候选产品，发现和开发治疗孤儿遗传性视网膜退行性疾病的方法，这种疾病的医疗需求远未得到满足。
我们拥有高度多样化的、治疗视网膜疾病的产品管线，除了我提到的两个AAV项目外，我们还与马萨诸塞大学医学院合作，使用微型基因方法，开发针对多种孤儿遗传性视网膜疾病的新的AAV基因治疗。AAV载体在我们可包装进载体的目的基因的大小方面有一定的限制。微型基因方法有可能克服这一限制。我们正在研究的三个项目就是利用这种方法，将较大的基因以更小、但仍具有功能的形式，包装进标准的AAV载体。
您能介绍一下您的AAV载体纯化步骤所面临的挑战吗?
基因疗法对行业来说是一项相对较新的技术，目前，只有极少数的疗法得到了FDA的批准。正因为如此，用于纯化的工具的选择在某种程度上也有限。尽管有CMO致力于建立平台方法，但这些方法并不总是真正得到了优化。
行业在下游领域面临的挑战之一直接与上游的复杂性有关。随着工艺的放大，在一致的水平上生成载体将变得更加具有挑战性。这种可预测性的缺乏给下游有效回收富集的衣壳、同时保证低杂质含量，带来了很大负担。
下游的另一个大挑战与分析有关。一方面是分析方法开发所需的时间；而另一方面与处理检测的长周转时间有关，其是向前推进开发工作的瓶颈之一。在开发过程中，时间往往是优化生产参数的限制因素。
（相关视频：病毒载体空 vs 完整衣壳及质粒定量分析，加快基因治疗上市时间）
您对载体纯化工具/技术的现状有何看法?首先，您能告诉我们您的主要“标配工具”是什么吗，还有这些工具在近段时间内是如何开发/优化的?
首先，需要再次说明的是，载体纯化仍处于其形成阶段。如果我们看看今天已有的工具，我们可以看到，其基本上是借鉴了基于蛋白质应用的方案。
这些技术，在某些情况下，我们已经针对基于血清型的病毒载体的特异性进行了改造，如亲和吸附剂。体积降低是AAV下游工艺的一个重要环节，而切向流过滤(TFF)和层析等技术是纯化的关键。层析设备 - 如整体柱和膜层析 - 最初出现在蛋白质应用中，以流穿模式操作，以去除宿主细胞DNA，现在已被病毒载体纯化行业所采用。
当然，与传统的装填柱相比，对流设备可以获得更高的载量，我希望看到这些设备继续发展和扩大，特别是对于空衣壳和完整衣壳的分离。这种分离是血清型特异性的，通常需要阴离子交换层析来实现，但这也需要大量筛选工作来优化操作条件。
您能更深入地介绍下目前病毒载体领域的关键差距吗，就是病毒载体领域需要哪些更特异性的工具，而不是重新利用蛋白质领域的工具?您希望在哪里看到更多的定制创新?
EG：我希望看到设计出更快、更有效的分析工具，来提高检测的“带宽”。更多高通量的方法来处理样本，加快周转时间，将允许我们更有效地推动开发决策。
同样，行业需要更多的小规模工具，来提高下游筛选条件的“带宽”。拥有一个高通量筛选方法对于开发层析应用是非常宝贵的，因为在设计这些方法时有很多的变量。我们严重依赖小规模工具，来处理细胞培养可以产生的东西。仅仅为了在完全结合载量的条件下研究1mL的层析设备，就可能需要生成相对较多的细胞培养物料。如果有小于1 mL的形式，将使我们有机会测试一系列条件，以更好地鉴定工艺的最佳参数，同时应对上游物料生产的限制。
（相关视频：自动化高通量病毒载体纯化）
考虑到预制层析形式，这些设备需要在规模放大时有更高的一致性。当使用填充柱以及明确的柱床高度，以线速度为目标，且当层析柱直径增加时，这可转化为体积流速，以处理细胞培养工艺的各种产量。虽然我们不受对流设备保留时间的限制，但我们仍然需要证明一致且稳健的可放大性。像滞留体积，或者线速度如何转化为体积流速这样的考量点，当从一种构型转换到另一种构型时，可能会发生变化。在从小规模到大规模的设计中建立更多的一致性，可以减轻规模放大的条件如何转换的负担。
在未来的创新方面，我有连续层析建模的经验，我希望看到用于病毒载体生产的连续工艺。我认为我们可以从半连续的方法中获益，包括从补料分批式生物反应器到捕获层析。当执行连续方法时，与批次模式相比，其会存在重叠的单元操作，批次模式中主要为独立的单元操作，中间有驻留步骤，而在连续工艺中，一旦从一个单元操作中产生了物料，它就会级联到下一个单元，直到最终有多个操作同时运行。每个操作的时间会被拉长，但当删除中间的驻留步骤后，总时间表会缩短。在低剪切条件下，通过缩短工艺时间，确保产物的完整性，可以节约成本。更低的流速可以规模缩小耗材的尺寸，从而提供成本效益，并为生产创造灵活性和安全性。目前，这对载体生产来说并不是一个巨大的挑战，因为其浓度低，批次体积小。一旦建立了一个强大的上游生产平台，我希望看到采用连续方法的载体纯化工艺。
（相关阅读：1. 腺相关病毒（AAV）工业化生产的下游工艺；2. 病毒载体生产：如何满足当前和未来的需求？；3. 解决AAV生产中上游变化给下游纯化带来的挑战；4. AAV载体生产平台选择和产品开发）
对于您来说，确保AAV载体最佳下游生物工艺开发的关键是什么?您是否可以分享任何关键的“应做和不应做”事项?
第一：花更多的时间优化上游工艺。下游工艺的好坏取决于你开始使用的物料。将更多的时间投入在建立病毒载体始终如一的高滴度生产的参数上，将最终节省投入到设计一个可行的下游纯化解决方案的时间。
第二：不要设计复杂的实验。将变量的数量限制为每个实验最多两个。通常，使用实验设计(DoE)时，我会进行两因素三水平DoE，来均匀地间隔实验点。简化实验设计可以减少准备时间，并将执行过程中可能发生的潜在错误数量降至最低。我通常会从广泛的条件开始，以产生有意义的结果，然后在需要时进行重复，以专注于更窄的条件范围。考虑到分析是我们的瓶颈之一，我们希望尽可能高效地从实验中获得有意义的数据。
第三：一定要在开发过程中考虑研究可放大性。与技术供应商接触，了解他们产品的全部范围和能力；它们如何整合到开发和生产环境中。关注能够提供灵活性的技术，以适应预期的操作体积。
第四：一定要考虑每个单元操作生成的料液如何进入下一个单元操作。理想情况下，目标是通过降低对产品体积的操纵，将简单性构建到工艺当中。这也反馈到关于连续方法的想法;我们不仅要在单元操作的背景下考虑，还要考虑它如何级联到下一个操作，以简化流程，并减少我们加给操作人员的负担。
最后，第五：不要忽视过滤对产物损失的影响。我们采用除菌过滤来降低工艺中间体储存时的生物负荷，并对最终药物底物进行过滤。当你考虑到产品体积是多么小时，尤其是在工艺接近结尾时，囊式过滤器的滞留体积可能会占到产物总体积的很大一部分。如果你需要进行多次过滤，还将进一步加重损失，就是说，我们会在过滤中浪费大量的产量。针对工艺中间体建立使用后冲洗方法、选择适当的过滤器尺寸、以及针对操作建立标准化的管路套件，将有助于更好地进行回收，实现操作的一致性。
最后，您能总结一下您自己和IVERIC bio在未来12-24个月的主要目标和优先事项吗?
现在这个时间节点对于IVERIC bio和基因治疗来说都是激动人心的时刻。这是一项开拓性的科学 - 尽管有很多挑战，但我认为挑战是让我们参与其中的原因。就我个人而言，我要“登上浪尖”。
对于IVERIC来说，我们的Zimura刚刚达成了一个重要的里程碑，这是一种新型补体因子C5抑制剂，用于治疗继发于年龄相关黄斑变性的地图样萎缩。去年6月，我们宣布了GATHER1积极的18个月结果，我们认为这是Zimura获批需要的两个III期临床试验中的第一个。公司的首要任务是在II期临床试验(GATHER2)中积极招募和保留患者。
随着我们继续朝着开发视网膜疾病的变革性疗法的目标取得进展，我们期待着2021年我们的两个基因治疗项目能够进行临床试验。
IVERIC已经有了很多令人兴奋的工作 - 我才来这里五个月，但就像他们说的，‘不是时间，而是里程’!
原文：E.Gershenow, Achieving optimal downstream bioprocessing for AAV vector. Cell & Gene Therapy Insights 2020; 6(11),1601–1606.
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