rAAV基因疗法快速制剂开发的分析工具包 - I
本文节选自来自Ultragenyx的研究人员发表的文章“Analytical toolkit for rapid formulation development of rAAV gene therapies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
重组腺相关病毒(rAAV)基因治疗产品已在数百个临床试验中用于治疗多种罕见的单基因疾病。rAAV基因疗法的商业成功也即将取得更多成果，因为两种产品最近获得了FDA的批准，分别用于治疗莱伯先天性黑内障和脊髓肌萎缩症。在临床和商业需求的驱动下，用于表征和放行这些产品的分析方法取得了重大进展。rAAV载体在不同的生物工艺条件下已被证明具有持续的稳定性，并假定在含有低水平表面活性剂的磷酸盐缓冲液(PBS)中是稳定的。然而，迄今为止，有关rAAV产品制剂和稳定性数据的报道相对较少，可能是由于此类工作需要大量的样品、时间紧迫且分析工具有限。传统的制剂开发方法数量少、效率低、精确性或准确性差。在这里，我们提出了一组与传统方法相比，更新的分析方法，重点是分析稳定性指示属性。该分析工具包具有在不同应力条件下从分子水平检测rAAV的能力，从而提供产品物理和生化属性的整体视图。更高的通量和快速周转、使用更少量的物料、同时提供多属性监测，使制剂能够快速开发，实现快速决策制定，并加快进入临床的速度。
简介
腺相关病毒 (AAV) 是1964年在腺病毒制剂中发现的一种污染性病毒。AAV是一种直径约24 nm的小病毒，其衣壳由60个亚单位蛋白组成，以3个病毒蛋白(VP1、VP2和VP3)以约1:1:10的二十面体构型组装而成。12种主要的AAV血清型(AAV1-AAV12)和100多种异构体已被确定可自然感染人体组织。重组AAV (rAAV)已被构建使用大小为4 - 5kb的治疗性转基因替换病毒DNA。rAAV能够在不同组织中特定位点的分裂和非分裂人类细胞中维持持久的游离转基因表达，这使得rAAV可广泛应用于基因表达，以精准治疗遗传缺陷性疾病。
血清型特异性的组织趋向性使得rAAV在精准医学上具有很高的应用价值。rAAV的靶向组织包括视网膜、肝脏、胰腺、肾脏、肺、心脏、中枢神经系统和肌肉。其趋向性与病毒衣壳的可变区(VR)、细胞表面受体、细胞摄入、胞内处理、载体基因组的核递送、脱壳、二链DNA转换有关。rAAV衣壳蛋白可以通过基因工程改善其趋向性，从而扩展到rAAV耐受性组织并优化其转导。rAAV异构体结构和组织的多特异性将需要更好的分子表征和平台，以快速筛选可行的制剂，保护rAAV在递送过程中不被降解，并确保与目标组织环境的兼容性。
针对冷冻储存的rAAV当前制剂方法已经进行了广泛的研究。目前已可成功实现rAAV的冷冻储存，如通过在磷酸盐制剂中添加各种糖赋形剂可避免冻融应激，添加表面活性剂可防止病毒滴度的损失，此外，添加适量的NaCl以尽量减少rAAV在冻融诱导的分配中发生的稀释诱导的聚集。另外，基于Tris的缓冲液制剂已经成功地用于替代磷酸盐，以进一步缓解冷冻过程中的pH变化。大多数临床rAAV产品使用上述制剂之一在冷冻条件下保存。随着产品开发用于治疗患者人数更多、地域分布更广的适应症，建立在非冷冻条件下可促进长期稳定性的条件将是有益的。
用于制剂开发的传统分析方法
rAAV临床试验数量的增加提高了对制剂开发的需求，以解决针对不同血清型、不同组织、扩大的递送途径以及非冷冻条件下稳定性的担忧。为满足同时存在的时间限制，需要一个制剂开发平台工具包，其应包含一整套样品用量要求低、通过高通量测试实现快速周转以及实现关键相关参数可靠测量的分析方法。
最佳的制剂应该保护rAAV产品不被降解，从而保持其感染性和效力，这对产品转导靶组织来说至关重要。典型的降解产物包括受损或不完整的衣壳、病毒蛋白片段、可溶性聚集和不可溶性聚集，如亚可见颗粒(SVP)。rAAV产品的功能还取决于递送到靶组织的基因组载荷、衣壳蛋白结构、病毒蛋白比例以及翻译后修饰(PTM)。在转导过程中发生的事件，如受体结合、细胞运输、核内体逃逸、核定位和脱壳，都与病毒蛋白质氨基酸序列及其PTM密切相关。评估rAAV产品转导所需的质量属性在制剂开发中非常重要，特别是在制剂对感染有直接影响的靶组织直接注射时。研究这些属性的分析工有针对转导的mRNA表达、针对基因组滴度的ddPCR、针对可溶性聚集和单体的DLS和SEC、针对SVP的自动显微、针对PTM的质谱，以及针对热稳定性预测的nanoDSF。
效力-功能评估
制剂开发的目的是确保制剂的rAAV产品保持其功能活性，使载体能够实现宿主细胞受体结合、细胞进入、细胞内转运、表达治疗性基因，形成具有生物活性的基因产品。效力评估涉及多种细胞事件，通常通过感染性试验 (培养基组织培养感染剂量TCID50)、转基因mRNA表达、蛋白表达和功能性分析 (蛋白质活性) 来评估，以在细胞或动物模型中检测转基因产物。每种类型的分析都提供互补的信息，以帮助确定影响载体性能的多个因素。体内研究通常在rAAV产品发现的早期阶段建立，有时用于rAAV临床产品的药效表征。
rAAV产品的效力通常也可以在基于细胞的试验中进行评估，在这种试验中，载体被加到体外细胞系统平台中，由此产生的转导通过感染性测量和/或在转导细胞内载体基因组转录后的mRNA表达来评估。常用的方法是依靠体外TCID50测定rAAV的感染性，这也是衡量衣壳和基因组稳定性的替代指标。据报道，TCID50具有±0.5log10的差异性 (尽管这种差异性可以随着开发而改善)，这导致在稳定性研究中，缺乏必要的精确性来区分轻微到中度的感染性下降。基于细胞的mRNA表达分析通过对加入体外细胞培养系统时、载体产品转导后的mRNA的定量，检测感染性通路的部分。这种基于细胞的分析比TCID50有更快的周转时间，可以设置在多个96孔板上进行平行测试，以实现更高的通量。用于效力评价的细胞系可能对制剂赋形剂敏感，需要对其干扰进行评估。例如，一些肿瘤细胞系，包括肝癌细胞，表现出了山梨醇诱导的抑制作用。
简单来说，基于细胞的效力分析方法有效且灵敏，可用于制剂开发以及加速稳定性研究，以评估各种生化环境和储存条件对产品生物学功能的影响。然而，这些方法可能需要不少的时间和资源，需要大量的培训、专业知识、时间和精力来分析一个多因素的实验设计。
载体基因组评估
rAAV产品通常由空衣壳、中间体和完全填充衣壳的混合物组成。只有完整的衣壳才能提供产品真正的治疗潜力，而空衣壳和中间性物质被认为是工艺相关杂质。因此，评估完整衣壳的病毒滴度对于评估功能和稳定性是至关重要的。冷冻透射电镜(cryo-TEM)、分析型超速离心法(AUC)等经典方法可以检测完整和空rAAV颗粒的分布，定量PCR (qPCR)可以评估拷贝数。Cryo-TEM提供了遗传物质的可视化和完整衣壳的视觉计数，而AUC提供了物质的详细描述 (空的、中间性异构体、完整填充、过度填充、聚集、片段、颗粒，小分子污染)的鉴定和可靠的定量，以及对每种物质所含DNA大小的估计。AUC/TEM与颗粒浓度相结合，可以准确、精确地估计病毒载量。然而，这两种方法都有明显的局限性。AUC每次运行需要消耗大量的物料，TEM通量低，周转时间长，而qPCR分析的差异性高，缓冲液基质可能干扰或抑制PCR扩增反应。
传统的qPCR方法具有较高的检测差异性，且缓冲液基质可能干扰或抑制PCR扩增反应。与qPCR相比，数字液滴PCR (ddPCR)具有更高的准确性和精确性，降低样品基质的干扰，近年来已成为rAAV产品基因组定量的行业标准。在ddPCR中，通过将样品分隔成液滴进行直接定量，从而消除了结果对PCR扩增效率的依赖。将Poisson分布应用于测量值的95%置信区间计算，进一步提高了ddPCR的准确性。已经有文章发布了对qPCR和ddPCR的综合比较。目前的共识是，对于含有PCR抑制剂的样品，与qPCR相比，ddPCR显著降低了差异性，特别是在浓度接近定量限时，并且对少量遗传物质的存在更灵敏。
基因组滴度分析是稳定性特性的一个基本组成部分，因为这些方法可以以高度的准确性和精确性检测衣壳完整性的损失，而且qPCR易于复用，从而实现高通量检测。然而，基因组滴度在检测某些条件下可能导致生物功能下降的降解方面的能力有限。例如，微小的衣壳变化或衣壳聚集可能会影响感染性，但如果仅用基因组滴度来衡量，可能检测不出这些变化。
聚集 & 单体
关键质量属性之一是聚集。浓缩的AAV或低离子强度制剂可能会促进聚体的形成，导致转导效率降低。SEC常被用来表征rAAV产品的高分子量（HMW）和低分子量（LMW）物质。然而，这种方法有两个局限性。SEC可检测的可溶性聚体的大小受筛板孔径和蛋白质–层析柱相互作用的限制，制剂中浓缩rAAV中的聚集在稀释至SEC流动相时会发生变化。DLS可以在其自然制剂中检测聚集，不需要稀释，最高可达2 μm，从而进行有意义的制剂比较。它根据Brownian运动来测量颗粒的流体力学大小。根据Rayleigh近似，二聚体的光强是单体的64倍，因为散射强度与颗粒直径的6次方成正比。因此，该技术对聚集比更小粒径的降解物更灵敏。当颗粒扩散速率随有效颗粒尺寸(颗粒形状)、温度、粘度、水合作用、稀释误差而变化时，粒径准确性一般。此外，聚体定量较差。尽管有局限性，DLS已经被用于研究与离子强度相关的聚集形成以及其它制剂研究。
与传统的DLS相比，新一代光散射仪器的精度和准确度得到了提高。Prometheus® Penta (NanoTemper，Cambridge，MA)和DynaPro® (Wyatt，Santa BarbaraCA) 就是其中的例子。除了在不经稀释的情况下检测制剂中的AAV粒径和聚体含量外，它们还提供了一种新的功能，用于评估AAV粒径在升温过程中的变化。我们用这两种仪器对AAV进行了评估，获得了约2% CV的相似粒径精确性。Penta报告AAV单体的粒径约为26nm，与冷冻透射电镜报告的24-26 nm一致。DynoPro还以低CV报告了AAV单体和聚体的粒径及浓度。总的来说，新一代光散射仪器是早期制剂筛选和稳定性研究的理想选择。该方法快速、非破坏性、样本量小，采用自然条件，且不需要方法开发。
与SEC正交的一组方法是场流分选法 (field-flow fractions, FFF)，尤其是非对称流场流分选法 (asymmetric flow field-flowfractions, AF4)，该方法基于层流和错流在自然缓冲液中引起的扩散，根据颗粒的粒径进行分离。高分辨率和大动态范围(1nm到1 mm)的优势可与SEC互补。结合多角度光散射(MALS)，它已被证明是表征rAAV在各种溶液环境中的稳定性的有效工具。然而，FFF方法并不是一种常规可用的工具，需要技术专家针对不同的样品定制测试方案。因此，对于早期快速制剂开发可能不太适用。
原文：J.Y.Wei, Y.Cai, J.Warren, Analytical toolkit for rapid formulation development of rAAV gene therapies. Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(9), 1295–1308.
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