病毒载体基因递送：平衡安全性、效率和剂量
本文节选自Amarna Therapeutics工艺开发首席科学家Thijs Gerritzen发表的文章“Viral vector gene delivery: balancing safety, efficacy and dose”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
体内基因治疗具有巨大的潜力，有可能在不远的将来被广泛应用。基因治疗不仅有望治疗而且有望治愈许多疾病。基因治疗最初的发展集中在基因替代疗法，即通过基因递送载体补充功能性基因，以增强在靶细胞中的基因功能。基因替代试验的早期成功已经证明了其治疗单基因疾病的潜力。未来的基因治疗可能会更进一步，通过个性化治疗修复实际的基因缺陷。最终，基因治疗可能被用于治疗常见疾病。
随着这些令人兴奋的发展，对基因递送载体提出了更高的要求。在过去的十年中，腺相关病毒(AAV)载体已经成为开发基因替代疗法的首选方法。然而，随着使用基于AAV的治疗进行的研究数量的增加，越来越多的人关注到了AAV载体的安全性问题。在临床试验中，尤其在高剂量组中观察到了不良反应。为了获得足够的治疗效果，通常需要这些高剂量。高AAV剂量与增强免疫激活有关，不允许“在免疫雷达下”运送其治疗性载荷。就像外科医生预防并发症一样，“隐形”递送基因治疗“货物”应该是研发人员的主要目标。因此，迫切需要新的体内基因载体来支持其发展。
除了使用高剂量以使基于AAV的疗法达到所需的疗效所造成的潜在安全风险外，它还为生产成本带来了巨大负担。典型的AAV给药剂量需要10^13、10^14甚至10^15 VG/kg。虽然很难把这些天文数字放在具体的背景中，但与病毒(载体)疫苗的背对背比较很容易揭示其真实面目。根据基因组拷贝数，腺病毒疫苗的剂量需求(~10^11VG/剂)或佐剂灭活疫苗的剂量需求(~ 10^8 VG/剂)要低很多。Zolgensma®是一种经监管批准的基于AAV的脊髓性肌萎缩药物，其给药剂量为10^14 VG/kg。即使不考虑可能的空衣壳，这一剂量也比靶细胞的数量高出多个数量级。该剂量甚至比估计的患者细胞总数高出10-100倍。如此高剂量的生产成本限制了基于AAV的基因治疗的适用性。尽管在工艺开发中克服了一个又一个限制，但产能仍然是一个挑战。目前估计每剂的生产成本约为10万美元。Merck Miillipore对AAV在经优化的专用设施中生产的商品成本进行了计算，使用乐观的下游工艺回收率为42%，显示每剂成本也将达到15,000美元。然而，在此计算中使用了3x 10^14 VG的保守剂量。虽然基因疗法最初的高价允许进一步扩大生产规模，但这是不可持续的。未来有可能会有可提高转导效率和降低免疫原性的替代性病毒载体，这从生产角度看，将是非常有趣的发展。
基因替代疗法的替代性载体可以基于生物工程复制缺陷病毒或非病毒方法。虽然从生产的角度来看，非病毒载体可能是一个很好的选择，因为产量通常较高，且成本低，但它们对于基因替代疗法来说有严重的限制。特别是，将DNA递送到靶细胞的细胞核仍然具有挑战性，而递送到细胞的细胞质更可行。从生物技术学家的角度来看，病毒似乎已经进化到可以用于基因治疗的程度。大多数DNA病毒需要宿主的细胞核来复制它们的病毒基因组，因此已经进化出有效的方法来将它们的核酸载荷递送到宿主体内。
图1. 优化的载体可以克服基于AAV的基因替代疗法的局限性。
目前基于AAV的基因递送的局限性和安全性顾虑如上图左所示。理想的载体(右)应该克服这些限制，有效地将其载荷有选择地递送到靶细胞，同时在免疫系统的“雷达之下”，以防止免疫原性。在避免随机基因组整合以防止遗传毒性的同时，应该通过增强基因的游离递送来获得持续的治疗效果。
多瘤病毒载体是发展新基因疗法的有希望的候选病毒之一。多瘤病毒含有凝聚在组蛋白上的dsDNA基因组。作为基因递送载体时，转基因以游离小染色体的形式递送。这种增强的基因递送模式可防止不必要的基因组整合，同时在细胞核中保持稳定。此外，这种多瘤病毒载体DNA递送方式预计将在免疫雷达的关注之下(图1)。对于基于AAV的基因治疗，DNA递送可能会激活免疫系统。在AAV生产过程中，DNA货物几乎没有甲基化。这就产生了未甲基化的CpG基序，即PAMPS，它通过TLR9激活触发免疫系统，其中DNA密码子的优化是规避这一缺陷的一种可能方式。此外，对于AAV，在人体中存在着预先存在的免疫力，并且在许多临床试验中一直是一个排除标准。AAV衣壳工程已尝试减少对衣壳的早期检测。或者，也可以通过使用非基于普通循环病毒的病毒递送载体来规避预先存在的免疫原性的挑战。猴多瘤病毒SV40有望结合这些特征并获得极好的转导效率。不幸的是，由于难以使用包含完整或大部分病毒基因组的细胞系进行制造，许多早期基于sv40的基因治疗尝试尚未达到临床测试。由于载体的同源序列和生产细胞中的野生型病毒基因组的重组，导致了具有复制能力的载体的产生。Amarna Therapeutics通过开发新的生产细胞系而克服了这一限制。
除了绕过免疫系统和降低剂量，控制转基因表达是未来基因治疗的一个重要方面。目前的基因替代疗法在努力达到足够的治疗性基因表达，因此不包含允许下调其表达的调控元件。随着时间的推移，这带来了转基因表达增加的风险 - 例如，在血友病基因治疗中，血液凝集因子的过表达可能会导致高凝状态。事实上，一项对使用AAV表达犬血液凝集因子的狗的长期跟踪研究表明，随着时间的推移，一些动物血液凝集因子的活性增加了。作者从整合位点分析中得出结论，这种增加是由包含整合的治疗性结构的细胞克隆扩增引起的。基因治疗“货物”的新特性应该被开发用于克服这种风险。最近的一种方法是通过生物可利用药物来控制可变剪接。该系统名为Xon，允许在体内控制治疗性基因的表达，为基因治疗提供额外的安全性。从理论上讲，通过使用新的基因编辑平台修复缺陷基因，可以达到控制治疗性基因表达的最高安全性。
总的来说，应该追求基因治疗的病毒载体多样化。替代性病毒载体可以带来安全性、生产的可放大性和成本方面的改善。新的病毒递送载体可以在到达靶细胞之前通过阻止免疫系统的干扰，而提高病毒递送到细胞的效率。在免疫系统检测不到的情况下进行递送，提高了在相对表达随时间降低的情况下重新给药的可能性(例如成长中的儿童)。提高效力可使基因疗法的剂量更接近疫苗使用的剂量。这减少了进一步扩大基因治疗生产规模的需要，并降低了基因治疗的成本。新的病毒载体将释放基因治疗的全部潜力，希望更低的成本使基因治疗能够更快得到广泛应用。
原文：T.Gerritzen, Viral vector gene delivery: balancing safety, efficacy and dose Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(8), 1119–1123.
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